[发明专利]人甲状旁腺激素与人血清白蛋白的融合蛋白的制备方法及产品

说明书

技术领域

人甲状旁腺激素与人血清白蛋白的融合蛋白的制备方法及产品，属于长效重组融合蛋白药物技术领域。

背景技术

人血清白蛋白(Human serum albumin，HSA)是血浆中的主要蛋白成分，在血浆中的浓度为40mg/ml(Phillip P.Minghettis et al.，THE JOURNAL OFBIOLOGICAL CHEMISTRY，1986 261：6747-6757)，它除了具有维持血浆渗透压功能外，还能结合内源性和/或外源性配体，包括激素、有毒代谢产物、药物等。通过结合这些配体，HSA可以调节激素活性、内源性和/或外源性物质的毒性和药物的利用度(Ji-Sook Ha et al.，Biochimica et BiophysicaActa，20031640：119-128)。David S.Park等构建的HalfHSA(截取HSA的前297个氨基酸残基)具有野生型HSA相应区类似的二级结构，同时保留了野生型HSA结合甲状腺素和甲状腺素类似物的能力(David S.Park et al.，IUBMB Life，199948：169-174)，细胞中刚翻译出来的人血清白蛋白具有典型的pre-pro-protein结构，包括18个氨基酸残基的信号肽和6个氨基酸残基前肽的原肽。信号肽和前肽在转运和分泌的过程中被切除，成熟的HSA由585个氨基酸残基组成，含有17对二硫键，分子量约为66.5KDa。通常情况下，HSA为非糖基化蛋白，然而有的突变体中也存在N-连接糖基化(见Uniprot中的protein ALBU HUMAN)。Peters的观点认为进化出大分子蛋白的优点是减小其在内循环时经肾排泄(Peters T.Jr.，Adv.Protein Chem.，1985 37：161-245)。HSA的分子量相对较大，在正常情况下，不易被肾小球滤过，其血浆半衰期在20天左右。

人甲状旁腺激素(human parathyroid hormone，PTH)通过与受体结合后激活腺苷酸环化酶和蛋白激酶C的活性，改变骨吸收和骨合成的速率，影响骨代谢。如果PTH的活性片段在较低或中等剂量的浓度下长时间作用于骨，则会刺激骨的形成，并且通过诱导骨中的合成作用而有效地治疗骨质疏松症。由于PTH分子量较小，易被肾小球滤过，因而在体内的半衰期较短，皮下给药或肌肉注射的半衰期一般在12h左右。为了达到治疗效果，一般需要频繁大剂量用药，为了克服上述缺点，人们通过对甲状旁腺激素加以修饰，以延长其半衰期。本发明将把PTH和HSA进行融合表达，通过研发人PTH的长效化技术，改善PTH体内药代动力学性状，研发出一种具有自主知识产权的长效新药。

发明内容

本发明的目的是提供一种人甲状旁腺激素与人血清白蛋白的融合蛋白的制备方法及产品。本发明的融合蛋白在保持了人甲状旁腺激素的生理特性的基础上延长其在体内的半衰期，改善其溶解度，在药学领域有良好的应用前景。

本发明的技术方案：从新鲜人甲状旁腺组织中分离单核细胞，刺激培养，提取RNA，通过RT-PCR反转录得到PTH cDNA；通过PCR从人胎肝cDNA文库中扩增获得HSA cDNA；利用重叠PCR技术，连接HSA cDNA和PTH cDNA，中间不加入任何连接肽，得到的PTH-HAS cDNA融合基因插入到克隆载体中保存；PTH-HAS cDNA融合基因在宿主系统进行表达，PTH-HSAcDNA融合基因被整合到宿主的染色体中。

PTH cDNA的克隆，HSA cDNA的克隆，HSA cDNA和PTH cDNA融合基因的克隆，融合蛋白PTH-HSA的重组酵母构建和融合蛋白PTH-HSA的表达的步骤详见实施例。

用上述方法制备的人甲状旁腺激素与人血清白蛋白的融合蛋白，包括与人血清白蛋白至少85％序列同源的第一区和与人甲状旁腺激素至少85％序列同源的第二区；所述与人血清白蛋白同源的第一区位于融合蛋白的C末端，所述与人甲状旁腺激素同源的第二区位于融合蛋白的N末端，中间不加任何连接肽；或所述与人甲状旁腺激素同源的第二区位于融合蛋白的C末端，所述与人血清白蛋白同源的第一区位于融合蛋白的N末端，中间不加任何连接肽。

优选的是所述融合蛋白包括与人血清白蛋白至少95％序列同源的第一区和与人甲状旁腺激素至少95％序列同源的第二区。

所述融合蛋白的第一区可以由人血清白蛋白部分结构域组成、或经结构域重排后的人血清白蛋白组成，包括所有HSA天然存在的多态型外，还包括HSA的部分片段，如EP322094中所述【名为HSA(1-n)，n为369-419】。