[发明专利]一种农杆菌介导转化柳枝稷的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物能源植物柳枝稷的基因工程利用领域，进一步涉及一种农杆菌介导转化柳枝稷的方法。

背景技术

随着国际石油价格大幅走高及石油产品大量消费导致生态环境的不断恶化，以燃料乙醇和生物柴油为特征的生物能源对于经济和社会可持续发展的战略意义日益增大。柳枝稷(英文名Switchgrass，拉丁名Panicumvirgatumlinn)因其栽培技术简单，适应性广，防风固沙能力强，耐瘠薄，生物学产量高，被国际上确定为生产燃料乙醇的首选生物能源植物，并投入了大量的人力、物力进行研究开发。其中，采用基因工程技术增强柳枝稷的抗逆性，提高光合效率，增加生物学产量，降低木质素含量和提高乙醇产率等方面已成为目前的研究热点之一。我国在近几年已引入柳枝稷作为防风固沙植物和优质牧草，并展示出良好的应用前景，但在生物能源尤其是采用基因工程技术育种研究方面尚处于起步阶段。

植物转基因技术以其把外源基因主动导入、定向改造植物的优点而日益受到人们的重视，已发展成为一种新的育种手段。其中，农杆菌介导的基因转化系统因其具有转化的外源DNA结构完整、遗传稳定、拷贝数低、转化的DNA片段较大等优点，已成为目前大多数植物基因转化的首选方法。在已获得的柳枝稷转基因植物中，也是采用农杆菌介导方法完成的。然而，由于柳枝稷的遗传转化研究起步较晚及转化较为困难，目前国际上仅有1例转基因成功的报道(M.N.Somleva，Z.Tomaszewski，and B.V.Conger.Agrobacterium-mediated genetic transformation of switchgrass.Crop Sci.2002，42：2080-2087)，而且转化效率较低(2％左右)。因此，加强柳枝稷的转基因研究就具有十分重要的现实意义。

发明内容

针对上述现有柳枝稷转基因技术存在的缺陷或不足，本发明的目的在于，提供一种高效的利用农杆菌介导转化柳枝稷的方法，该方法能够使转化效率达到10％左右，为采用转基因方法对柳枝稷进行遗传改良提供研究基础和技术支持。

为了实现上述任务，本发明采用如下的技术解决方案：

一种农杆菌介导转化柳枝稷的方法，其特征在于，该方法按如下步骤进行：

步骤一：人工诱导幼穗为外植体

在柳枝稷生长发育至有6个节时，人工切取最上处茎节，切取部位包含茎节上下区段长度各1～1.5cm，灭菌；以MBP培养基上人工诱导幼穗，其中，MBP培养基为：MS无机盐和维生素混合物4.43g/L、麦芽糖30g/L、6-BA(6-苄基氨基嘌呤)3mg/L、琼脂粉7.5g/L，PH＝5.8，28℃条件下光照培养至幼穗长度为1～1.5cm。

步骤二：诱导胚性愈伤组织

将人工诱导幼穗切成0.2mm，同一人工诱导幼穗的切块置于同一器皿中，24℃条件下以SMB培养基暗培养，诱导胚性愈伤组织，其中，SMB培养基的配方为：MS无机盐和维生素混合物4.43g/L、蔗糖30g/L、2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)5mg/L、6-BA(6-苄基氨基嘌呤)0.15mg/L、PVP(聚乙烯吡咯烷酮)4.0g/L、琼脂粉7.0g/L，PH＝5.8。

步骤三：农杆菌转化和共培养

挑取农杆菌的一单克隆于含有卡那霉素和利福平的50mL的LB或AB培养基中，在28℃条件下，以200rpm/分钟～250rpm/分钟培养1～2天，至农杆菌菌株浓度为OD₆₀₀＝0.8～1.0。其中，LB培养基为：10g胰化蛋白胨、5g酵母提取物、10g氯化钠，PH＝7.0；AB培养基为：AB无机盐和磷酸盐溶液、葡萄糖5g/L，PH＝7.0；

在LB或AB培养基中加入50μl 100mM乙酰丁香酮继续培养1～2小时；

将培养基转入无菌的50mL离心管中，常温下，3500rpm/分钟，离心15分钟收集农杆菌，以液体M1培养基重新悬浮农杆菌，调节农杆菌菌株浓度为OD₆₀₀＝0.5；其中，液体M1培养基为：MS无机盐和维生素混合物4.43g/L、蔗糖30g/L、2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)1.5mg/L，PH＝5.8；

用镊子将愈伤组织夹成直径为1mm～2mm的块状，加入悬浮好的农杆菌菌液，同时加入40μl 100mM乙酰丁香酮，在真空台上抽真空10～15分钟后，常温下，以50rpm/分钟～60rpm/分钟培养20～30分钟；