[发明专利]CRM197突变体的纯化方法

说明书

技术领域

本发明涉及利用重组DNA技术生产基因工程药物，具体涉及大肠杆菌表达的CRM197突变体的纯化方法，属于医药技术领域。

背景技术

CRM197(cross-reacting forms of toxin 197)是白喉毒素丧失了毒性的一种突变体，它是由野生型白喉毒素的碱基序列中由一个碱基G突变为A，从而导致了第52位氨基酸GLY突变为GLU。从结构上看，CRM197具有完整的白喉毒素功能结构，但实验表明，NAD结合位点的变化影响了白喉毒素的酶活性及毒性。后来研究证明52位的GLY在白喉毒素NAD结合位点起着重要作用，这就导致白喉毒素酶活性位点--同NAD：EF2ADP核糖转移酶结合区发生改变，导致CRM197片断A不能与EF2结合，不能对细胞起到毒性作用。

CRM197不具有酶活性以及毒性，但具有白喉毒素的免疫原性，因此CRM197也常被用作一种免疫蛋白载体交联其它半抗原一起作为疫苗。早在1985年美国科学家就利用CRM197的免疫原性，将嗜血流感菌表面的多糖交联到白喉类毒素及CRM197的蛋白载体上制作疫苗防治呼吸道感染，从防治效果上看，两种交联疫苗在效果上没有显著差异，但都能使小孩产生较强的免疫记忆。美国科学家针对小儿在2岁前对于肺炎球菌疫苗(球菌表面多糖，PnPs)不能产生免疫记忆，因此将球菌表面七价多糖交联于多种蛋白载体以便在小儿2岁前能对肺炎球菌产生抗体，经过多种蛋白载体交联后的动物及临床效果比较，发现PnPs-CRM197能产生较好的免疫效果，而且安全无毒副作用。目前该产品也已通过美国FDA批准上市，商品名为Prevnar。意大利科学家Francesco针对流行性脑膜炎也采用了利用其病菌表面多糖交联CRM197制作疫苗，他们从CRM197的结构上分析了交联的可行性，其中CRM197带有39个Lysin氨基酸残基和16个Arg残基，能提供较多的交联用的游离氨基。从实验结果来看，虽然化学交联率较高，但都没有达到理论交联率。

美国专利US6,962,803描述了白喉毒素CRM107采用棒状杆菌表达分泌到培养液中，得到的CRM107毒素收率虽然比较高，可高达培养基总蛋白的70％以上，但是由于培养基中的成分比较复杂，且盐离子强度较高，导致后续的纯化过程比较困难，工艺复杂，成本偏高，目的产物收率低等。

针对现有CRM197的不足，海南天源康泽医药科技有限公司对原有CRM197的基因序列进行了改进，构建了表达CRM197的重组表达质粒并转化至大肠杆菌表达宿主中以包涵体形式表达。参见中国专利CN200610042194.7。

发明内容

对于采用大肠杆菌以包涵体形式表达重组CRM197突变体，本发明提供一种适宜于规模扩大化生产的快速、简便、高效的CRM197突变体的纯化方法，具有工艺简单、成本低，目的产物收率高以及中间过程便于控制和易于规模化放大生产等特点。

本发明CRM197突变体的纯化方法，包括如下步骤：

(1)采用大肠杆菌以包涵体形式表达重组CRM197突变体，包涵体经过变、复性后得到含有目的蛋白组分的复性液；

(2)复性液通过超滤进行分离和浓缩，并用Tris-HCl缓冲液进行换液，将复性液浓缩5-25倍，得超滤浓缩液；

(3)上述超滤浓缩液通过阴离子交换层析进行纯化层析，截留核酸和大部分杂蛋白质，得到含有目的蛋白CRM197突变体的分级组分；

(4)用平衡缓冲液对阴离子交换层析系统进行平衡，使目的蛋白吸附到阴离子层析柱上，大部分杂质穿出阴离子层析柱；

(5)用添加了NaCl的平衡缓冲溶液对上述步骤(4)处理后的阴离子交换层析柱进行洗脱，使目的蛋白穿出阴离子交换层析柱，收集洗脱蛋白液，即得目的蛋白液。

经过上述步骤的处理，得到的目标蛋白CRM197突变体的纯度高，一次处理量大，且收率大大提高，为大规模生产提供了技术基础。

上述步骤(1)中的变、复性方法可采用蛋白变、复性通用的方法。

上述步骤(2)中所述的复性液通过超滤进行分离和浓缩，可一次性进行超滤浓缩，也可先超滤去除大分子蛋白或杂质，再进行超滤浓缩。

在层析前加上超滤浓缩步骤，除去复性液中的大、小分子蛋白、多肽或其它杂质，以利于后续步骤的操作。