[发明专利]一种冷冻保存神经干细胞的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术与组织工程领域，涉及一种冷冻保存细胞的方法。

背景技术

组织工程技术是将体外培养扩增的正常组织细胞接种于一种具有优良细胞相容性，并可被机体降解吸收的生物材料中形成复合物，然后将细胞与生物材料复合物植入人体组织、器官的病损部位，在逐渐被机体降解吸收的同时，细胞不断增殖、分化，形成新的、且形态和功能与相应组织、器官一致的组织，从而达到修复创伤和重建功能的目的。

胶原蛋白因其具有无抗原性、生物相容性好的特点，不仅可以促进细胞生长代谢，参与组织愈合、诱导组织再生，而且，植入体内后能在体液、酶、细胞等的作用下发生降解，变成小分子物质被肌体吸收或通过新陈代谢排出体外。因此成为组织再生工程的首选的生物材料。

随着以胶原为主要支架材料的组织工程产品，在临床上逐渐得以应用，长期冷冻保存是一个需要解决的问题。Dixit等人将肝细胞包埋于含有胶原的三明治结构的微胶囊中进行冷冻保存，解冻后的细胞保持较高活率，并且保持正常的分泌功能。Wu等人用甲基化胶原和半乳糖胶原替代了天然胶原制备三明治结构的微胶囊包裹肝细胞进行玻璃化冷冻，进一步证明胶原这种细胞-生物材料复合物在冷冻的过程中对细胞的形态和功能均有一定的保护作用。

低温保存技术主要分为两种形式：一种是慢速冷冻法；另一种是快速冷却非晶态固化，即玻璃化法。在组织细胞低温保存的过程中，细胞外结构损伤是低温下细胞、组织和器官长期保存的主要障碍。如果要保持其结构和功能的完整性，就应该避免降温和复温过程中冰晶的形成，以及冷冻保护剂导入和导出过程中由于细胞膜两侧渗透压不平衡所造成的“渗透休克”。其中避免和减轻“渗透休克”的方法是冷冻保护剂的浓度变化应渐升或渐降，以避免较大的浓度梯度出现。I型胶原由300nm，三股螺旋原纤维组成，凝固成胶后形成非取向的网络，其空隙的大小由胶原的浓度决定。因此，当冷冻保护剂加入细胞-胶原复合物时，其具有复杂的孔道结构，大大降低了冷冻保护剂的渗透速率，起到了一种“缓渗”作用，从而减轻细胞膜两侧渗透压差骤变带来的伤害。另外，胶原的基本化学特征是含有羟赖氨酸糖类，羟基与水分子中的氢作用，干扰了水分子冷冻结晶的排布规则，因此，可能减少冰晶形成对细胞的机械损伤，也起到保护细胞的作用。

神经干细胞(neural stem cells)是一类多能干细胞，能够长期自我更新(复制)，同时具有分化形成神经元、星型胶质细胞和少突胶质细胞的多潜能特性。它们是中枢神经系统内长期提供新细胞(神经元和胶质细胞)的源泉。目前已在多种动物模型及人体中尝试过将神经干细胞移植到纹状体等脑神经病变区及受损伤的脊髓中，并获得一定疗效，但要广泛地应用于临床治疗领域，其来源和数量仍远远不能满足需求。而且还存在移植细胞源于待移植患者在时间和空间上的匹配问题。因此神经干细胞的体外大规模扩增，以及将扩增后的细胞进行冷冻保存，建立资源丰富的“神经干细胞库”，就成为一个重要的研究课题。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种新的冷冻保存神经干细胞的方法。

本发明的技术方案如下：

1)确定冷冻保护剂DMSO在室温15℃下，加入到胶原-神经球复合物中的平衡时间为15min；

2)制备15％2×DMSO的冷冻培养液；

3)离心收集“神经球”(神经干细胞聚球增殖生长)，计每10ul体积的神经球数。准备冷冻保存的“神经球”的直径不要超过100μm，否则影响冷冻效果；

4)制备胶原-神经球的混合液，胶原的终浓度为1.75mg/ml，神经球的密度为1×104个/ml；

5)将胶原-神经球混合液转移到2ml的冻存管中，每管250μl，在37℃，2小时胶原凝固成胶；

6)将制备好的冷冻培养液加入到含有胶原-神经球凝胶的冻存管中，每管250μl，室温平衡15分钟。

7)将冻存管转入控速降温冻存盒(Nalgene，Rochester，NY)中，并将冻存盒放置于-85℃冰箱，4小时后，将冻存管转入-196℃液氮中长期保存。

8)37℃水浴，快速复温，吸出弃掉胶原-神经球凝胶上层的冷冻保护液。加入新鲜培养基500μl，室温平衡5分钟，吸收弃掉；重复该步骤3次；

9)将胶原-神经球凝胶从冻存管中转移到培养板中继续培养，准备进一步的生物学特性的检测。