[发明专利]一种海洋枯草芽孢杆菌及其筛选方法

说明书

技术领域

本发明涉及海洋微生物应用生物技术及杉木根际土壤真菌病害防治，具体的说是一种用于防治杉木人工林根际土壤真菌病害的海洋枯草芽孢杆菌及其筛选方法。

背景技术

杉木(Cunninghamia lanceolata)是我国特有的速生丰产的用材树种，分布在我国南方的17个省、市、自治区，现有杉木人工林面积1214.07万公顷，约占我国人工林总面积的24％。多年来的研究表明：随着杉木连栽代数的增加，杉木生产力就会下降，出现杉木连栽障碍。杉木纯林连栽，土壤肥力下降，杉木幼苗立枯病害增加，土壤中有毒物质积累，土壤微生物数量逐年减少，土壤中致害真菌增加，环境退化日益严重，栽种第3代杉木土壤上的20年生杉木人工林较同年栽种第1代杉木，其胸径、树高和立木蓄积分别降低22％、30％和54％。杉木连栽引起生产力下降是一个普遍现象，究其原因有很多，例如过去对土壤养分转化受阻，土壤养分含量下降，土壤理化性状变劣，杉木病虫害增多报道较多，而对引起杉木连栽障碍之一是土壤微生物多样性大大减少，对杉木生长致害的病原真菌明显增多，经过微生物学鉴定杉木连栽土壤中主要致害菌中的尖孢镰刀菌萎蔫专化型(Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum)，正青霉菌(Eupenicilliumberfeldianum)等，所引起的杉木连栽土壤中毒，使杉木幼苗枯萎等毒害尤为突出这方面的研究报道不多。近五年来，对杉木纯林连栽后出现真菌病原菌增多，有毒物质积累，引起土壤中毒、地力下降，杉木幼苗立枯病严重的情况，予以了足够的重视，但尚没有理想的、针对性的防治技术，亟需早日能够有新的生防技术，解决杉木人工林土壤病害及地力衰退问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种海洋枯草芽孢杆菌及其筛选方法，本发明获得的海洋枯草芽孢杆菌菌种可用于防治杉木人工林根际土壤真菌病害，进一步可制成用于杉木人工林土传真菌病害的防病减毒微生物制剂。

同时，本发明还提供了一种可以对杉木根际土壤真菌病害防治的海洋枯草芽孢杆菌进行有效筛选的方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种海洋枯草芽孢杆菌，其为Bacillus subtilis 3728C，已经于2007年4月23日保藏在中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏号为CCTCC No.M 207052。

所述海洋枯草芽孢杆菌的筛选方法为：

1)菌株初筛：以红树林(Mangrove forest)的木榄(Brugiera gymnorrhiza)幼根根表土壤为分离菌种的样品，将带有根表土壤的木榄幼年根样品剪成0.5-4cm长小段，而后放于盛有海水的三角瓶中，三角瓶放在70-90℃水浴中，热处理15-20分钟(以杀灭根表土壤样品中的非芽孢菌，达到有效分离高活性目的菌株)，取出冷却，用稀释平皿分离方法涂平皿，进行初筛，初筛平皿放在25-30℃保温箱中保温培养36-60小时，以形态观察挑取单菌落，编号；

所述其木榄幼根为幼年支持根。此时的幼年根有弹性，筛管纤维中空，似海绵状，有充气容氧的效果，此时的杉木幼年根根表土壤中的海洋芽孢杆菌与木榄幼根间有联合共生的作用(老年根已木质化，无理想菌株可筛选)，用此土壤样品作为筛选分离菌种的样品，经相互拮抗试验筛选与定向筛选相结合方法进行菌种筛选后，可以获得目的菌株。

所述初筛用的培养基采用牛肉膏蛋白胨麦芽汁琼脂培养基，具体的说就是以等重量的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，与等重量的糖度为波美7度的麦芽汁琼脂培养基，分别装瓶，灭菌冷却，临用时分别加热融化，无菌室内混合均匀倒平皿使用。

2)菌株复筛：将上述初筛得到形态特征为枯草芽孢杆菌典型的菌落，移接到盛有牛肉膏蛋白胨琼脂的斜面试管中，分别挑取单菌落5-10个，放置于25-30℃保温培养36-60小时，供复筛用；

复筛采用平皿拮抗试验方法，所述平皿相互拮抗试验筛选模型与定向筛选相结合的方法，是以已经分离得到杉木人工林根际土壤中主要致害真菌为靶标菌株，与已经分离纯化的木榄幼根根表土壤中得到海洋芽孢杆菌菌株之间进行拮抗试验筛选与定向筛选相结合的方法，筛选出高活性的海洋芽孢杆菌。

具体为：以杉木根际土壤病害真菌为靶子菌，按常规方法在平皿上进行对峙的拮抗试验，在25-30℃保温36-60小时，取出平皿，检测初筛菌株对靶子菌的抑菌圈大小，抑菌圈直径达到16mm或16mm以上的为合格，择优保存；