[发明专利]一种猪伪狂犬病新型亚单位疫苗制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种猪伪狂犬病新型亚单位疫苗制备方法。

背景技术

伪狂犬病是多种动物共患性传染病，猪是其自然宿主，感染猪康复后呈隐性感染，主要引起妊娠母猪流产、死胎或木乃伊，初生仔猪出现神经症状、麻痹、衰竭直至死亡，死亡率几乎100％，断奶仔猪发病率为20％-40％，死亡率为10％-20％，该病已成为目前种猪繁殖障碍综合症的主要病因，并明显呈逐年上升趋势。由于成年猪多为隐性感染，并长期带毒和排毒而成为潜在的传染源，给该病的控制和消灭带来极大的困难。目前世界各国对PR的有效预防主要是疫苗免疫接种，现有的猪伪狂犬病疫苗有油乳剂灭活疫苗及传统的弱毒疫苗和基因缺失疫苗，这些疫苗的不足之处在于：如油乳剂灭活疫苗安全性好，但免疫效果不理想，注射局部副作用大，血清学检测不能区分疫苗免疫抗体和强毒抗体；弱毒疫苗免疫效果良好，但不能区分疫苗免疫抗体和强毒抗体，且存在毒力返强的危险；基因缺失弱毒疫苗免疫效果良好，并能区分疫苗免疫抗体和强毒抗体，但基因缺失苗可能会因基因重组变为强毒株等潜在的不安全问题。因此，改进现有的疫苗成为各国研究人员攻克的难题，国外已开展了猪伪狂犬病亚单位ISCOM疫苗的研究，其不足之处在于：以强毒为制苗种毒，疫苗制备复杂繁琐，疫苗的保存期不明确，限制了疫苗的规模化生产和临床应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种猪伪狂犬病新型亚单位疫苗制备方法，本发明以伪狂犬病毒弱毒株(PRV-FB株)为种毒，提取PRV-FB囊膜蛋白为免疫原，应用新型佐剂QuilA和离心透析相结合的免疫刺激复合物制苗新技术，研制成安全有效的猪伪狂犬病新型亚单位疫苗，研制出的疫苗可用于猪伪狂犬病的预防和控制，并为动物病毒性重大疫病的新型疫苗研究开拓一条新途径。

本发明所述的疫苗的制备方法是：将PRV-FB株细胞毒经差速离心后，重悬于PBS中，调整病毒抗原的蛋白浓度，加入Mega-10裂解病毒囊膜蛋白，以离心方法提取囊膜蛋白，加入适当的ISCOM基质，装袋透析即为PRV新型亚单位疫苗。

本发明是以伪狂犬病毒弱毒株(PRV-FB株)为种毒，提取PRV-FB囊膜蛋白为免疫原，应用免疫刺激复合物(ISCOM)制苗新技术，研制成安全有效的猪伪狂犬病新型亚单位疫苗，可用于猪伪狂犬病的预防和控制；本发明首次在国内外全面系统测定了该疫苗的生物学特性、疫苗的安全性、免疫原性、保存期、抗体持续期、攻毒保护率和最小免疫量等各项免疫学指标。该疫苗主要含囊膜糖蛋白不含核酸，不存在疫苗毒的潜伏感染问题，安全性好；同时，优化了囊膜提取技术，简化了生产工艺，ISCOM的应用解决了亚单位疫苗免疫原性差的难题。

附图说明

图1是PRV囊膜蛋白免疫刺激复合物电镜照片(×10万)复印件。

具体实施方式

以下通过试验例来进一步说明本发明及本发明的有益效果，(但不是对本发明的限制)。

本发明所述的疫苗制备方法是：将PRV-FB株细胞毒经差速离心后，重悬于PBS中，调整病毒抗原的蛋白浓度，加入Mega-10裂解病毒囊膜蛋白，以离心方法提取囊膜蛋白，加入适当的ISCOM基质，装袋透析即为PRV新型亚单位疫苗。

PRV囊膜蛋白亚单位疫苗不含核酸成份，安全性好，且血清学方法能将自然感染动物和疫苗接种动物区别开，但免疫原性差。为此，本发明人进一步采取如下措施，提高其免疫效果：

(1)上述PRV-FB弱毒的特征与培养是：伪狂犬病毒弱毒株(PRV-FB株)是经乳兔肾原代细胞连续传180代结合蚀斑克隆和低温诱变技术选育出的弱毒株，PRV-FB株对猪、牛、羊等家畜已无致病性；对易感家兔和乳猪盲传五代，无返强现象；接种动物同居接触感染末发现水平传播。上述PRV-FB弱毒株能在如CEF、MDEF、PK-15、VERO、RK、Marc-145等多种细胞上生长，本发明考虑到产业化生产的需要，上述PRV-FB弱毒株选用CEF或Marc-145细胞为病毒培养细胞；PRV-FB病毒的培养是将PRV-FB株种毒接种CEF或Marc-145单层细胞，接种量为培养液量的1％，37℃旋转培养至细胞病变达80％时，收获细胞毒。

(2)上述病毒抗原的制备为：将PRV-FB细胞毒经-20℃冻融3次，5000rpm离心30-60mins，取上清35000rpm离心90-120mins，取沉淀重悬于PBS中，调整病毒抗原的蛋白浓度为10-12mg/ml，即为制苗用病毒抗原。