[发明专利]一种生产有效生物反应器的方法

说明书

发明领域

本发明涉及一种生产有效生物反应器的方法，该方法包括在本发明描述的生物反应器中培养动物细胞，通过反应器的器壁和细胞之间的摩擦增加动物细胞悬浮培养液中溶氧的方法。 

发明背景 

动物细胞的高密度悬浮培养是蛋白类药物或疫苗产品开发的有用工具。常常需要小体积的细胞培养罐用于动物实验研究的样品生产，较大体积的细胞培养罐用于临床研究药品的生产。许多细胞生物学家喜欢应用简化的小型悬浮培养装置，但放大专家则喜欢“易于优化”的大体积细胞反应器系统。 

目前的生物反应器培养罐和摇瓶的形状都是很典型的柱体形。这样的罐体或瓶工作体积的高∶径比大于1∶1。罐体中的培养基表面积不足于氧气被有效吸收。常用空气或氧气喷射来解决这一问题。然而，过量的空气喷射常产生泡沫和使气泡破裂，同样过量的氧气喷射也毒害细胞。因此，用较复杂的控制塔和相关的溶氧探头来监控空气或纯氧的喷射。不过，优化控制塔或探头比较昂贵。因此，需要开发无控制塔和无相关溶氧探头的小体积培养罐，特别是一次性罐体，和“易于优化”的大体积培养罐。 

本专利的这种设计允许不使用复杂的控制塔和相关的探头来大体积培养细胞，也开发了一次性或可灭菌的小体积摇瓶型的悬浮培养系统。还研究了一个“易于优化”的搅拌器驱动的大体积工业化倒置的平锥底生物反应器系统。 

本发明描述了一种生物反应器，即一种悬浮细胞培养罐，该培养罐是一种宽体平锥底可在摇床上用于悬浮培养动物细胞的细胞反应器，与传统的生物反应器和平底摇瓶相比。该培养罐可以使细胞液很容易地波及罐壁，产生很小的机械张力，形成了较宽的薄培养液层，有利于扩大表面积，增大气体交换量，改善混合效果。 

本发明进一步的利用该培养罐对培养液进行培养，发现了一种在培养液中增加溶解氧的方法。 

发明内容

本发明提供一种利用细胞培养罐对培养液进行培养的方法，特别是在本发明描述的培养罐中对培养液增加溶解氧的方法。 

对于细胞培养，本发明发现只要培养基表面积与培养基体积比高于0.14cm2/cm3，不利用复杂的控制塔和相关的溶氧和pH探头，也可以使悬浮的动物细胞生长良好，这种培养是在宽体平锥底培养罐(图1)中，通过底部的空气喷射或表面的纯氧供给，在37℃用带有20-25mM HEPS的无血清培养基进行培养的，与传统的柱体搅拌罐相比宽体平锥底摇瓶具有表面通气好的优势。 

本发明是首次利用摇瓶培养罐来培养动物细胞，惊奇的是，它们工作的效果比传统的Applikon平底反应器好，在细胞密度、重组蛋白产量、细胞活力和细胞皮实性方面优势明显，显然结合了摇床、平锥底、宽体和pH稳定的培养基，工作起来对动物细胞培养和重组蛋白的产量具有优势。 

本发明的宽体平锥底培养罐的特点是有效的锥体角度，用塑料的不同锥角的锥底离心管研究了锥角对固定转角摇动、培养基混合、接种体积的影响，发现如果锥角太小(比如小于30度，或者太宽，大于70度)，摇床不能使培养基很容易地波及管壁。 

本发明的宽体平锥底培养罐特点是3升悬浮培养罐不用复杂的控制塔和相关的溶氧、pH探头，通气是通过位于锥底最低点的空气喷射来进行，可延长气泡的行程，或者在培养基表面通纯氧。 

应用此种宽体平锥底培养罐研究了表达的TNFR1Fc-IL-lra，IL-18bp-Fc-IL-lra，VEGFR1-Fc-IL-lra，and Tie2-Fc-IL-lra的CHO细胞的培养，令人吃惊的是，宽体平锥底培养罐工作明显地好于平底的Applikon搅拌型反应器和平底的摇瓶，显然摇床摇动能够推动培养基波及罐体壁，且不产生剪切力和机械张力，形成较大范围的薄培养基层流，有利于扩大通气量， 

本发明是在上述宽体平锥底培养罐基础上，采用了溶氧探头、pH探头和相应的探测系统(www.flurometrix.com)(图2a，b).同时也利用数码相机拍照并研究宽体平锥底培养罐中培养基的运动规律。 

首先，测定了宽体平锥底培养罐中工作体积为150ml培养液的溶氧值(图3)。发现溶氧水平很容易达到100％(表1)。然后用空气泵在相同的罐中静态向培养液中 泵入空气，惊奇的是，在一定的时间内不能达到100％的溶氧(表2)，对这种现象非常惊奇，因为日常用的3升Applikon的反应器都是用泵入空气法来较正溶氧探头并设定溶氧为100％的，在这种现象的背后必然存在着一种作用机制。