[发明专利]使用粉体来提高转化效率的方法

说明书

技术领域

本发明是关于通过土壤杆菌属细菌来高效地进行将基因导入到植物材料中的方法。 

背景技术

作为主要谷类的玉米、水稻等单子叶植物的转化方法，已知有电穿孔法、基因枪法等。然而，这些物理的基因导入法存在将多拷贝的基因导入，基因并不能以完整的形式插入，转化植物畸形、不育等多种问题。 

根据土壤杆菌法的基因导入，是利用土壤杆菌机能的植物转化方法。土壤细菌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens，根瘤土壤杆菌)具有下列机能：感染植物时，使作为与土壤杆菌病原性相关的Ti(tumor-inducing)质粒的一部分的T-DNA整合到植物基因组中。根据土壤杆菌法的植物转化方法是下述方法：制备将Ti质粒的T-DNA结构域置换为希望向植物染色体组中导入的基因的转化用质粒，使用制备成具有以该转化用质粒代替了Ti质粒的土壤杆菌，通过利用土壤杆菌的上述机能，将希望向该植物染色体组中导入的基因导入到植物染色体组中的方法。 

使用土壤杆菌属细菌的基因导入法，作为双子叶植物的转化法被普遍使用。由于认为土壤杆菌仅以双子叶植物为宿主，并不寄生在单子叶植物中(DeCleene，M.and De Ley，J.，(1976)Bot.Rev.，42：389-466)，进行了关于根据土壤杆菌法转化单子叶植物的尝试(Grimsley，N.，等，(1987)Nature，325：177-179；Gould，J.，等，(1991)Plant Physiol.，95：426-434；Mooney，P.A.，等，(1991)Plant Cell，Tissues and Organ Culture，25：209-218；Raineri，D.M.，等，(1990)Bio/technology，8：33-38)。据这些研究报告，显示了在水稻、玉米、小麦等稻科作物中也可以利用土壤杆菌进行基因导入，但每个都存在重现性的问题，除此之外，在导入的基因的确认方面不完全，并未显示具有说服性的结果(Potrycus，I.，(1990)Bio/technology，8：535-542)。 

Chan等，在2，4-D(2，4-二氯苯氧基乙酸)共存条件下，将培养两天的 水稻未成熟胚创伤后，在含有马铃薯悬浊培养细胞的培养基中接种带有nptII基因与GUS基因的土壤杆菌。在添加了G418的培养基上培养处理过的未成熟胚，由被诱导的愈伤组织得到再分化的植物体。据报道，再分化的植物体及其后代的植物体中的GUS基因的存在由southern分析确定再分化当代、后代任何的植物体中都已被确定有导入基因的存在(Chan，M-T.，等，(1993)Plant Mol.Biol.，22：491-506)。此结果支持了由土壤杆菌对水稻的转化，但转化率为1.6％，非常低，相对于供试的未成熟胚数250，显示为正常生长的再生植物体仅有1个。由于剔除水稻的未成熟胚需要大量的工作，这样低的转化率很难说达到实用的标准。 

近年，报道了通过利用带有强病原性土壤杆菌的一部分病原性基因的超级双元载体(super binary vector)，在水稻、玉米等单子叶植物中也能稳定、高效地转化(Hiei，Y.，等，(1994)，The Plant Journal，Vol.6，p.271-282；以及Ishida，Y.，等，(1996)，Nature Biotechnology，Vol.4，p.745-750)。根据这些报道，通过土壤杆菌的转化，可以稳定、高效地转化，并且所得到的转化植物变异少，被导入的基因复制数少，而且具有完整形态的植物很多的优点。继水稻、玉米成功之后，作为主要谷类的小麦(Cheng，M.，等，(1997)Plant Physiol.，115：971-980)、大麦(Tingay，S.，等，(1997)Plant J.，11：1369-1376)和高梁(Zhao，Z.-Y.，等，(2000)Plant Mol.Biol.，44：789-798)的通过土壤杆菌的转化也有报道。