[发明专利]用于预防甘油三酯的酶促水解的基于柠檬酸三乙酯的组合物

说明书

发明领域

本发明涉及在营养品、化妆品或药品中用于保护甘油三酯免于酶促水 解的新组合物。

现有技术

甘油三酯或三酰基甘油包含三个分别与甘油的三个羟基基团酯化的脂 肪酸。甘油三酯是疏水的非极性分子。

在简单生物体和复杂生物体内，植物或动物来源的甘油三酯构成了重 要的能量储备。

甘油三酯存在于许多食物中，例如(仅用于说明而没有限制性目的) 在植物油如橄榄油、向日葵油、花生油等，以及动物性脂肪如黄油中。

甘油三酯对皮肤具有特别的功能作用，特别是在病理状况如痤疮、脂 溢性皮炎和其它由于某些能够水解该分子、释放脂肪酸和甘油的酶(属于 酯酶类，特别是脂肪酶类)的作用而使甘油三酯的完整性发生改变的病症 中有作用。

根据现有技术，当与甘油三酯组合时，还没有对于水解甘油三酯的酶 而言能够用作优选底物的化学方法，所述的酶属于酯酶类，更具体而言是 脂肪酶类(无论其来源是细菌、植物或动物)。

现在，发明者所进行的下述特别研究和实验，本文认为已经显示出活 性成分柠檬酸三乙酯在抑制甘油三酯的酶促水解中发挥了特别的活性。

在猪的脂肪酶存在下，使用显色试验通过分析所释放的脂肪酸来评估 甘油三酯水解的抑制。

该试验包括两个不同的阶段，一个是酶促反应试验，其在猪的脂肪酶 存在下能够水解甘油三酯释放出橄榄油，接着是显色试验，测定所形成的 游离脂肪酸。

猪的脂肪酶在底物(橄榄油)存在下和合适的孵育条件下催化下述反 应：

甘油三酯+水→甘油二酯+脂肪酸

根据脂肪酸的量，间接评估酶促活性及甘油三酯的水解。

为了排除所分析的底物的抑制活性，将三个不同浓度的待测底物(5％、 1％和0.5％，于水中)在两个不同的反应时间内(15和30分钟)进行测试。

为使底物完全溶解，将5％浓度的溶液于室温放置72小时。

在使用前将猪的脂肪酶在4℃下溶于去离子水中，浓度为2000U/ml。 使用橄榄油作为甘油三酯的来源。反应使用的缓冲液为Tris HCl 200mM， pH＝7.7，反应温度为37℃。在不同浓度下，按有无底物的情况进行试验。

将下述试剂在37℃混匀：去离子水(150μL)，缓冲液(100μL)，橄榄油 (300μL)。

对于样品(TEC 5％、1％及0.5％)而言，用150μL的待测溶液代替水。

随后，将酶溶液(200μL)加入，反应于37℃分别进行30和15分钟。 在15和30分钟的反应时间终点，加入300μL的95％乙醇终止反应。

使用50μL含有所形成的游离脂肪酸的所述溶液作为生色剂量，使用 提供了进行下述反应所必需的试剂的特定试剂盒进行测定。

在乙酰辅酶A合成酶(AcylCS)和腺苷-5′-三磷酸酯(ATP)存在下，游离 脂肪酸被转化成乙酰辅酶A、腺苷-5′-单磷酸(AMP)和焦磷酸酯。在乙酰辅 酶A氧化酶(ACOD)存在下，乙酰辅酶A和氧(O₂)反应形成2，3-烯酰辅酶A。 所产生的H₂O₂在过氧化物酶(POD)存在下将2，4，6-三溴-3-羟基-苯甲酸 (TBHB)及4-氨基安替比林(4-AA)转化成红色染料。

样品在加入ACOD之前和之后于546nm波长下读数，该反应在室温 下进行。

脂肪酸+CoA+ATP→乙酰CoA+AMP+焦磷酸酯

乙酰CoA+O₂→烯酰-coA+H₂O₂

H₂O₂+4-AA+TBHB→染料+2H₂O+HBr

按照所述方法，从吸光度值可见，柠檬酸三乙酯能够保护甘油三酯免 于脂肪酶的酶促水解多达85％的比例。

             吸光度的平均值    与对照相比，脂肪酸的还原(％)

             15′     30′         15′          30′

对照         0.7125   0.095        --            --