[发明专利]抗凝血酶III的亲合色谱法

说明书

本发明的目的是亲合色谱柱，它包含与固体载体连接的ATIII蛋白。

这些肝素，即动物源的硫酸化粘多糖混合物，是糖胺聚糖类的生物活性剂，它们具有特别有用的抗凝血性质。它们是由因其尺寸而非常异类的硫酸化多糖直链构成的。一些肝素的平均重量是约15000Da(来源：猪粘液)。

将肝素长多糖链截断成低分子量的更短链可以制备低分子量肝素(HBPM)和非常低分子量肝素(HTBPM)。因此，HBPM和HTBPM应该理解是其分子量分别为3000-6500Da和1500-3000Da的链。

抗凝血酶III(ATIII)(Chandra等人，1983，《(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.》，80：1845-1848)是一种特定的蛇根平，它对控制凝固的丝氨酸蛋白酶有低抑制活性。这种作用肝素存在下明显得到增强，该肝素连接并且激活ATIII。特别地，与肝素的连接引起在蛋白质中一组构象的变化，该变化与采纳非常有利于与靶丝氨酸蛋白酶相互作用的构象同时达到最高程度。ATIII是在激活构象中时，与肝素分子或启动构象变化的衍生分子的相互作用是明显得到增强。

肝素与ATIII的相互作用是由于特定的五糖序列。然而，仅仅三分之一多糖段具有能与ATIII的相互稳定作用的特定序列。因此，肝素与衍生物的制备在涉及对ATIII亲合性方面是异质的。重要的是能够考虑富集对ATIII亲合种的低聚糖群，这样一种富集能显著提高这个群的抗凝血活性。

在等人(1976，FEBS Lett，66：90-93)中描述过分离肝素亲合部分和非亲合部分的ATIII亲合色谱法。曾发表了其它方法，但是再次采用等人方法的基本点(Hopwood等人，1976，《FEBS Lett.》，69：51-54；Denton等人，1981，《Anal.Biol.》，118：388-391；Pixley& Danishefsky，1982，《Thromb.Res.》，26：129-133)。根据这种方法，在乙酰化肝素的存在下，将ATIII接枝在用CNBr活化的Sepharose B树脂上。使用肝素的目的是防止在与肝素键合位点处都接枝ATIII。

这种技术有两个主要制约因素。

首先，连接ATIII所使用的肝素是乙酰化肝素，以便避免有与乌洛托品残基NH₂竞争的风险。然而肝素乙酰化作用表现在其亲合性严重降低，和因此其对键合位点的保护能力降低，从而能连接亲合种的ATIII分子数减少。

另一方面，从使用ATIII浓度来看(约7mg蛋白质/ml水合树脂)，纯化与ATIII亲合种时，在这些能与ATIII连接的多糖分子之间存在着严重的空间不便的风险。

本发明的目的是亲合色谱柱，它包含与固体载体连接的抗凝血酶蛋白III(ATIII)，其特征在于：

a.蛋白ATIII是野生蛋白或其变体，

b.使用未改性的并富含活性种的低分子量肝素(HBPM)通过孵化预先激活蛋白ATIII，

c.按照低于每ml水合树脂约2mg蛋白的比率，让蛋白ATIII以共价方式与树脂连接。

未改性的HBPM应该理解是在制备后未进行化学或酶改性的HBPM，特别地，它没有被乙酰化。富含活性种的HBPM应该理解是富含与ATIII亲合的多糖的HBPM。

根据本发明，树脂应该理解是在其上接枝ATIII的化学惰性大分子载体。这些载体特别地非限制性地包括琼脂糖珠、琼脂糖聚丙烯酰胺珠、多孔玻璃珠、聚乙烯或聚甲基丙烯酸酯珠，按照制造商指示或本技术领域的技术人员熟知的方法，其中特别是使用溴化氰与使用肼的接枝方法在该珠上接枝ATIII。当然也可以使用预活化树脂。

根据本发明非常特别有利的实施方式，使用的树脂是Sepharose，采用的接枝技术是使用溴化氰的接枝技术。

本发明的亲合色谱柱具有双重优点。

一方面，使用为保护ATIII键合位点而未改性的HBPM能够固定呈激活构象的蛋白。在这种构象中，ATIII对亲合种的亲合性比没有预先激活的通过伯胺连接的ATIII强得多，选择性也高得多。

另一方面，低浓度的ATIII允许与这些亲合种相互作用而没有在它们之间的空间不便。当寻求分离大尺寸的种时，本发明的这种性质对于是特别有意义的。

为了使所有这些ATIII分子激活，优选使用饱和量的非改性的富含亲合种的HBPM。