[发明专利]肝祖细胞

说明书

本发明涉及由成体肝脏组织分离祖细胞的方法、通过本发明方法分离的肝祖细胞以及诱导分离的肝祖细胞分化的方法和肝祖细胞条件永生化与代谢选择的方法。更具体地说，本发明涉及肝祖细胞，其尽管是肝来源的，但在形态上与肝卵圆干细胞不同，不表达代表肝卵圆干细胞的标记。另外，本发明的肝祖细胞显示出自我更新能力和多谱系分化潜力，这些特征使得可以将这些细胞分类为多能祖细胞。

例如在WO 03/078588、WO 00/43498、WO 00/03001、EP 1394263、US 2003/0138951的现有技术中公开了肝干细胞，包括人肝干细胞。大部分已知的肝干细胞由于其特征性的卵圆形而被称为肝卵圆干细胞。卵圆干细胞是已明确鉴别的肝干细胞类型。其典型特征除了其特征性卵圆形态以外，还有一种或多种代表造血干细胞的表面标记的表达，例如c-kit(CD117)、CD34和Sca-1，提示卵圆干细胞起源于造血干细胞。而且，卵圆干细胞是能够在体内产生肝细胞和胆管细胞这二者的双能祖细胞(Petersen B.E.Goff J.P.Greenberger J.S.Michalopoulos G.K.(1998)Rat oval cells express the hematopoietic stemcell marker Thy-1 in the rat.Hepatology 27，433-445；Petersen B.E.Grossbard B.Hatch H.Pi L.Deng J.Scott E.W.(2003)Mouse A6-positive hepatic oval cells also express several hematopoietic stem cellmarkers.Hepatology 37，632-640)。

现在，本发明人令人惊奇地发现了一种由成体肝脏组织分离祖细胞的方法，该方法产生分离的新祖细胞群，该新祖细胞群的特征在于表达某些代表肝细胞的细胞标记，例如白蛋白和α-甲胎蛋白，以及没有代表卵圆干细胞的形态和分子特征。实际上，本发明的新肝祖细胞在形状上为上皮样的，而不是卵圆形的。而且，这些细胞似乎不表达代表肝卵圆干细胞的某些造血细胞标记。

因此，在第一个方面，本发明提供一种分离非卵圆人肝祖细胞系的方法，所述细胞系表达肝细胞标记，优选为白蛋白和α-甲胎蛋白，所述细胞系优选不表达造血细胞标记，所述方法包括以下步骤：

(i)在细胞培养基中培养成体肝脏来源的人成熟肝细胞，直至成熟肝细胞死亡，并选择具有上皮样形态的存活细胞群；

(ii)通过在含血清、含葡萄糖的培养基中培养扩增存活细胞群，所述培养基补加hEGF(人上皮生长因子)和bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)，并包含哺乳动物细胞生长必需的常见无机盐、氨基酸和维生素。

按照本身已知用于由哺乳动物肝脏(优选人肝脏)分离肝细胞的任意方法，由成体肝脏组织获得用于本发明方法的成熟肝细胞。本文所用表述“成体肝脏组织”的含义在现有技术中已得到充分确认，其指由出生后生物获得的肝脏组织。表述“成熟肝细胞”的含义在现有技术中也已得到充分确认。该表述包括不具有体外增殖能力的完全分化的肝细胞。成熟肝细胞的常用分化标记是生物化学标记，例如白蛋白、酪氨酸转氨酶(TAT)、细胞色素P450、TO、丝氨酸脱水酶(SDH)、Cxs 32和26以及形态标记，例如胆小管形成、间隙连接、具有晶状类核体的过氧化物酶体、大量线粒体(参见例如Mitaka T(2002).Reconstruction of hepatic organoid by hepatic stem cells.J HepatobiliaryPancreat Surg.9(6)：697-703)。

成熟肝细胞任选可在培养前在防冻剂存在下冷冻在含血清培养基中。肝细胞优选地冷冻在液体培养基中，所述液体培养基含20％热失活胎牛血清(FCS)或人血清(HS)，并含二甲亚砜(DMSO)作为防冻剂。或者，已知具有防冻特性的任意其它化合物都可用作防冻剂，例如甘油、乙二醇、聚乙二醇或聚乙烯吡咯烷酮。冷冻优选在非常低的温度下进行，例如通过将细胞样品放置于-80℃，随后放置在液氮中。

本发明的分离方法包括第一步和第二步，在第一步中，对成熟肝细胞的原代培养物进行负选择，在第二步中，扩增存活细胞群。