[发明专利]用磁珠支持基质及质谱判断质谱多肽谱和蛋白指纹的用途

说明书

技术领域

本发明涉及一种新的生物样品中蛋白质分析方法，具体指用于生物样品分析的蛋白指纹法。本发明还涉及用磁珠支持的基质捕获蛋白质组并采用计算机可读取的条码格式(蛋白指纹)分析的蛋白指纹法。所述的条码格式(蛋白指纹)，其条码带(分子量)意义的确定采用了加减法，即加入或减去某种物质来确定其质谱分子量的意义。蛋白指纹法确定某生物样品在第一和第二(加入或减去某种物质)样品中蛋白指纹差异：两种蛋白指纹图的差异条码带肯定了其分子量在生物样品中的临床意义，从而判断每一条码带中单一蛋白指纹的意义。蛋白指纹中的蛋白质单一蛋白指纹及分子序列可以用于离体体液的试剂盒的检测方法。

背景技术

不论是细胞的正常功能还是病理特性都在一定程度上取决于细胞所表达的蛋白质功能。因此，鉴定细胞内表达的蛋白质的区别，可用于诊断疾病，并最终用于药物开发和疾病治疗。而要进行蛋白质表达和功能的差异化分析，要求能够达到分辨细胞内分子的复杂混合物的程度。但细胞内许多物质往往以微量存在，目前用于分析蛋白的方法在上述各方面都有局限，用这些常规手段难以进行定性鉴定和定量分析。

如，一种常用的分子分离方法是凝胶电泳。通常是用凝胶内等电点聚焦先分离蛋白质，再用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳进行第二次分离。结果得到一张根据等电点范围(净电荷)和大小(质量)来区分蛋白质的图。虽然有用，但是该方法存在以下几方面的局限。首先，该方法只提供生物分子的两项特征-质量和等电点(pI)。其次，各维度的分辨率受到凝胶分辨能力的限制。例如，通常很难区分质量差异小于5％或pI差异的生物分子。第三，凝胶的容量和灵敏度都有限，可能无法检测出少量表达的生物分子。第四，无法观察到分子量低于约10-20kDa的小蛋白或小肽。

又如，临床诊断疾病一般方法是要求特异性地检测出疾病的已知标记。但是，制备特异性结合标记并且能在复杂的混合物中鉴别出标记的试剂需要大量时间，这阻碍了此类诊断方法的发展。

其它分析方法可能克服以上局限之一或几项，但是难以将它们有效组合。例如，分析层析能够根据多种分析物/吸附剂相互作用来分离生物分子，但是作多维度分析却困难而费时。而且，该方法的灵敏度也很有限。

用质谱的方法测定蛋白质是较新的方法。但没有与用磁珠支持的基质法联合应用时，质谱分析方法只能对蛋白质进行定性分析，无法进行定量分析，尤其在是样品中混合物复杂，蛋白质含量极小的情况下。

蛋白指纹技术最早源于马铃薯/土豆品种鉴定(Desborough S and Peloquin SJ，American Potato Journal.45，220-229；1968 and Desborough S and Peloquin SJ，Theoretical and Applied Genetics.39，43-47；1969)。当时用电泳技术来区别分不同品种土豆。因为不同品种的土豆在电泳下有不同的蛋白指纹组合。由于人体细胞蛋白比土豆要复杂的多，故仅用电泳来鉴别疾病的蛋白指纹远远不能满足临床需要。

用磁珠支持的基质法中先将待测样品与选定的吸附剂结合，然后检测滞留在吸附剂上的分析物。用磁珠支持的基质法时需将分析物先从吸附剂上洗脱进行检测。用磁珠支持的基质法与质谱联合应用其优点是能够从复杂的样品混合物中准确地分辨出分析物分子量。并且能够根据分子量大小将生物样品组成按条码格式排列。用磁珠支持的基质法可以将血清蛋白排出成千上万条分子量带。但目前人血液中只有289个蛋白分子量可以被临床应用，未见到文献有用磁珠支持的基质法进行蛋白指纹鉴定分析并且解读出成千上万条分子量带的方法学(Anderson NL and Anderson NG，Molecular & Cel lular Proteomics1：845-867；2002)。

发明内容：

本发明的目的是建立一种确定某生物样品在第一和第二样品中蛋白指纹差异存在的意义。包括A)测定生物样品在第一样品中至少一种选择性条件下的第一蛋白指纹图；B)测定生物样品在第二样品中(减去某种物质：某种特异性单克隆抗体柱子处理过的；或加入某种物质)相同选择性条件下的第二蛋白指纹图；和C)比较第一和第二蛋白指纹图之间的差异。利用加减物质法来判断两种蛋白指纹图的差异条码带肯定了分析物在样品中的蛋白质分子序列及意义，从而判断每一条码带中单一蛋白指纹的意义。蛋白指纹中的蛋白质单一蛋白指纹及分子序列可以用于离体体液的试剂盒的检测方法。

本发明采用蛋白指纹法对蛋白质组进行鉴别。