[发明专利]重组日本七鳃鳗口腔腺分泌L－250蛋白抗凝血功效

说明书

技术领域

日本七鳃鳗口腔腺分泌具组胺释放因子活性的TCTP模体蛋白-L-250的基因克隆与表达属于生物技术领域。涉及日本七鳃鳗口腔腺分泌L-250蛋白的cDNA序列及克隆，与其对应的蛋白质氨基酸序列及其在大肠杆菌或毕赤酵母中的表达，及L-250蛋白作为组胺释放因子，刺激嗜碱性粒细胞释放组胺。组胺能增强血管内皮细胞表面表达凝血酶调节素TM，一方面它能与凝血酶结合，降低凝血酶活性；另一方面能够活化蛋白C，从而触发抗凝血级联反应。这提示，L-250蛋白的组胺释放因子活性在抗凝及心脑血管疾病治疗方面具有潜在的应用价值。

背景技术

日本七鳃鳗(Lampetra japonica)系圆口纲(Cycpostomata)、七鳃鳗目(Petromyzoniformes)、七鳃鳗科(Petromyzontidae)、七鳃鳗属(Lethenteron)。在进化上因连接着脊椎与无脊椎动物而具有极高的研究价值。在海水中营半寄生生活，以其特有的口吸盘吸附在其他鱼类躯体上，靠吸食其血肉生存，并使宿主流血不止，提示在其口腔腺中存在某种抗凝机制。

血管内壁主要存在两种抗凝机制，分别为蛋白酶类凝血抑制机制和蛋白酶抑制剂类抑制机制。在蛋白酶类凝血抑制机制中，蛋白C起主要作用。蛋白C(PC)为丝氨酸蛋白酶，是由肝脏分泌的一种生理性抗凝剂，它以酶原形式存在于血浆中，PC在自然状态下是无活性的，经凝血酶的激活，可成为活化的蛋白C(APC)。APC通过使已活化的VIII因子、V因子等凝血因子灭活，从而抑制凝血过程。然而，凝血酶对PC的激活是相当慢的、凝血酶只有与存在于内皮细胞膜表面的血栓调节蛋白，又叫做凝血酶调节素(TM)形成复合物后，才能有效地激活PC。TM是内皮细胞膜上的凝血酶受体之一，与凝血酶结合，会降低凝血酶活性，并加强凝血酶激活蛋白C的作用。因此，TM是使凝血酶由促凝转向抗凝的重要的血管内凝血抑制成份。

翻译控制肿瘤蛋白(Translationally controlled tumor protein，TCTP)又叫做组胺释放因子，被认为在慢性过敏性疾病中起重要作用。该家族蛋白具有2个特征结构域，即TCTP-1([IFAE]-[GA]-[GAS]-N-[PAK]-S-[GTA]-E-[GDEV]-[PAGEQV]-[DEQGAV]和TCTP-2([FLIV]-x(4)-[FLVH]-[FY]-[MIVCT]-G-E-x(4，7)-[DENP]-[GAST]-x-[LIVM]-[GAVI]-x(3)-[FYWQ])，这2个区域在不同物种间具有高度的序列同源性。1995年MacDonald等首次发现了这一蛋白家族的细胞外生物学功能，通过对过敏病人体液中和遗传过敏症儿童淋巴细胞中存在的Ig-E依赖性组胺释放因子进行氨基酸末端序列分析，发现组胺释放因子与小鼠和人的翻译控制肿瘤蛋白具有同源性，TCTP能够刺激人嗜碱性粒细胞释放组胺，人血吸虫和疟原虫等多种寄生虫可分泌TCTP至宿主血液中，刺激宿主细胞释放组胺，从而影响宿主免疫应答。此外，组胺还能够引起血管扩张效应，增强局部血流；使血管内皮细胞表面凝血酶调节素TM的表达增高，它一方面能与凝血酶结合，降低其活性；另一方面能够活化蛋白C，活化的蛋白C能够阻碍凝血因子Xa与血小板的结合，并刺激纤溶酶原激活物的释放而促进纤维蛋白溶解，还能在其辅因子蛋白S的作用下灭活凝血因子Va和VIIIa，这三条通路最终都能够引起抗凝血反应的发生。本发明首次发现了存在于日本七鳃鳗口腔腺中的TCTP模体蛋白新基因，并将其命名为L-250，而且本项目的日本七鳃鳗口腔腺中TCTP模体蛋白-L250具有组胺释放因子活性，能够刺激嗜碱性粒细胞释放组胺，从而引发一系列抗凝血级联反应的发生，提示L250蛋白将在临床抗凝治疗方面具有应用价值。

发明内容

本项发明在日本七鳃鳗口腔腺cDNA文库中发现了L-250蛋白的开放阅读框，经对其mRNA全长的进行钓取、测序、及cDNA克隆，对其重组蛋白在大肠杆菌中进行高效诱导表达。L-250重组蛋白生物学活性涉及作为组胺释放因子，刺激嗜碱性粒细胞释放组胺。

本发明涉及日本七鳃鳗口腔腺分泌L-250蛋白的cDNA序列及克隆、与之对应的蛋白质序列及其在大肠杆菌或毕赤酵母中的表达，及其刺激嗜碱性粒细胞释放组胺的生物学活性，以及抗凝血方面的应用。