[发明专利]草坪草矮化相关基因GA20

说明书

一技术领域：

本发明属植物生物技术领域或作物育种领域。具体说，涉及结缕草的培养、RNA的提取、引物设计、基因克隆和载体构建的相关技术。从而从结缕草中获得了GA20氧化酶基因，并构建了该基因的正义和反义植物表达载体。

二背景技术：

草坪具有绿化美化、水土保持、调节小气候、观赏和运动等功能，对于居民休憩、娱乐及景观等具有举足轻重的作用。目前，北京已建植草坪4000多公顷，年增250多公顷，为北京的环境美化与首都人民生活质量提高发挥了重要的作用。然而，草坪修剪与灌溉等耗费了大量的人力和物力，通常30％～40％的管理费用于草坪草修剪。矮化的草坪草以其低修剪率、低耗水率而受到越来越多的重视，逐渐成为草坪草育种工作的一个方向。

赤霉素(GA)是调节和控制植物生长最基本的一种内源激素，它有许多与植物生长和发育相关的生理功能，如诱导α-淀粉酶的形成，促进禾谷类种子萌发、节间和叶片伸长，促使茎的伸长和植株增高，促进花器官、孤雌生殖和果实形成等。当植物体内GA的浓度过大时则会抑制植物生长。大多数植物体内的活性GAs以GA1或GA4为主，中间产物和非活性GAs(结合态GAs)有几十种。二十世纪60年代小麦矮化品种的育成推广是该时期农业增产的主要原因。这些小麦品种是因为基因突变导致其赤霉素作用靶位点正常感知能力失活，从而引起矮化国外已有科学家将目光关注于转基因矮化草坪草新品种的培育上，主要是应用矮化基因、系统选育和杂交育种等方法。而这方面结合赤霉素合成相关基因的研究目前还没有报道。

GA20氧化酶是一种双加氧酶，需要2-酮戊二酸和氧分子做为辅底物，Fe²⁺和抗坏血酸为辅因子，直接催化生成具有生物活性的GAs，而且在植物矮化型和徒长型突变体内表达丰度差别很大，因此GA-20氧化酶是最重要的也是目前研究最多的赤霉素生物合成的限速酶。GA-20氧化酶基因首先从南瓜中克隆出来，随后利用南瓜编码GA20氧化酶的cDNA片断合成异源探针，筛选拟南芥基因组文库获得拟南芥GA-0氧化酶基因。这之后，在菠菜、豌豆、烟草等多种植物中获得了该基因的克隆。目前已有20-30种GA20氧化酶基因被克隆出来。

北京林业大学草坪研究所针对国内草坪草基因工程育种研究缺乏自有基因资源，缺乏具有自主知识产权的有用基因，以及社会对优质矮化草坪草新品种的迫切需要等问题，从上世纪90年代初就开始进行国外优良草坪草的引进工作及国内草坪草种质资源的收集整理工作；同时，在国家“863”项目与国家植物转基因与产业化专项的资助下，进行了结缕草、早熟禾、高羊茅、黑麦草、翦股颖等材料的转基因抗逆性改良研究，获得了一批优质高抗逆性草坪草新品系。结缕草(Zoysia Japonica Steud.)是我国资源丰富的唯一不需要进口的草坪草种，具有适应性强，耐旱、抗热、抗寒、耐践踏和耐贫瘠等许多优良性状。本发明从调控植物生长的激素-赤霉素着手，从结缕草中克隆赤霉素生物合成过程中的关键酶-GA20氧化酶基因，研究其作用机制，进一步通过正义与反义表达载体的构建，为下一步获得矮化草坪草新品系(种)的转基因研究工作奠定了基础。

三发明内容：

本发明以中国野生结缕草为材料，采用简并PCR和RACE法获得了GA20氧化酶基因。在此基础上，以载体pC1303为基础，构建了GA20氧化酶基因的正义和反义植物表达载体。

本发明的主要步骤包括：以结缕草为植物材料，提取植物总RNA，反转录成cDNA，利用生物软件设计引物，经过简并PCR和RACE的方法获得了GA20氧化酶基因全长cDNA序列，并以pC1303为基础，分别构建了植物正义和反义表达载体。

四附图简要说明：

图1总RBA电泳图；图2目的基因中间片段电泳图；图3目的基因中间片段的核苷酸序列；图4目的基因3′片段基因电泳图；图5目的基因3’端的核苷酸序列；图6目的基因5’端基因电泳图；图7目的基因的5’端的核苷酸序列；图8目的基因全长电泳；图9目的基因全长核苷酸序列；图10GA20氧化酶基因与其同源基因的比较；图11GA20氧化酶基因载体构建图；图12GA20载体构建酶切检测电泳图；图13GA20载体构建PCR检测电泳图

四具体实施方式：

1材料的准备

结缕草取自北京东北旺北京林业大学草坪研究所试验站种质资源圃，采其匍匐茎，带回实验室种植在花盆中，精细管理，长出幼叶后用于实验。

2方法

2.1总RNA的提取和双链cDNA的合成