[发明专利]一种从感病昆虫血淋巴中分离纯化昆虫病原真菌菌体的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种从感病昆虫血淋巴中分离纯化昆虫病原真菌菌体的方法。

背景技术

目前对于昆虫病原真菌致病基因的研究，主要是建立在不同离体条件下的诱导表达序列标签库(以下称EST库)，如通过建立金龟子绿僵菌(广谱菌株)在不同离体条件下的诱导EST库，分析大量EST序列，以期利用大量不同离体条件下的诱导EST序列分析病原真菌在侵入寄主昆虫体内后基因的表达情况等，但此方法既耗时、又费力，并且难以检测在活体条件下特异表达的病原真菌基因。

而在病原真菌侵染后的寄主昆虫血淋巴中分离纯化到无寄主DNA和RNA污染的病原真菌菌体是分离和克隆病原真菌在寄主体内表达基因的关键技术。从寄主昆虫体内直接获取病原真菌菌体，以分离和克隆昆虫病原真菌菌体侵入昆虫体内后表达的基因，研究它们在致病机理中的作用，一直是业内人士渴望解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从感病昆虫血淋巴中直接分离纯化昆虫病原真菌菌体的方法。

本发明的目的是这样实现的：一种从感病昆虫血淋巴中分离纯化昆虫病原真菌菌体的方法，其特征在于：将感病昆虫的血细胞采用酶处理进行裂解及其DNA和RNA采用酶处理进行降解，再加以分离沉淀，纯化制得病原真菌菌体；在整个酶解过程中，采用聚合酶链式反应(以下称PCR)检测保守序列监控，最后采用PCR和逆转录-聚合酶链式反应(以下称RT-PCR)检测保守序列方法对昆虫病原真菌菌体进行鉴定。

上述感病昆虫的血细胞经超纯水处理、离心分离后，其沉淀与蛋白酶K进行裂解反应；裂解反应完成后，其离心沉淀与核酸酶进行降解反应，以降解其RNA和DNA，最终分离出的沉淀为昆虫病原真菌菌体和细胞碎片；在整个酶解过程中，采用昆虫的保守基因序列设计昆虫特异性引物来检测昆虫核酸是否存在，昆虫病原真菌保守基因序列设计昆虫病原真菌的特异性引物作为检测有无昆虫病原真菌核酸的存在，通过PCR和RT-PCR扩增检测酶解后检测昆虫的保守基因序列量的多少及有无来判断酶切进程，实现对整个酶切过程的全过程监控以及对昆虫病原菌菌体进行鉴定。

上述感病昆虫是指东亚飞蝗，上述病原真菌是指绿僵菌；上述感病东亚飞蝗的血细胞中加入超纯水洗涤，血细胞数∶超纯水的体积＝3.0×10⁶个∶1000-2000μl；洗涤、离心分离除去上清液的血细胞中加入细胞裂解缓冲液，血细胞数∶细胞裂解缓冲液的体积＝1.0×10⁶个∶100-200μl，混匀后加入10％十二烷基磺酸钠(SDS)至终浓度为1％，混匀后加入蛋白酶K后，30℃水浴1～2小时，离心分离弃去上清液，洗涤沉淀；再在沉淀中加入核酸降解缓冲液，其加入量以前面所计的感病东亚飞蝗的血细胞数加入核酸降解缓冲液，血细胞数∶核酸降解缓冲液的体积＝1.0×10⁶个∶100-200μl，再加入脱氧核糖核酸酶DNAase I、核糖核酸酶RNAase A，使其终浓度均为0.5mg/ml，混匀后30℃水浴30-45分钟，离心分离弃去上清液，洗涤沉淀；每次洗涤后的上清液，取10μl作模板进行PCR反应，2％琼脂糖凝胶电泳，以分析东亚飞蝗血细胞的裂解及DNA、RNA的降解的情况；从沉淀中提取DNA或mRNA，并用东亚飞蝗特异性引物和绿僵菌特异性引物做PCR和RT-PCR，以验证是否污染了东亚飞蝗的遗传物质及沉淀是否为绿僵菌菌体。

本发明所采用的蝗虫保守基因为蝗虫的组蛋白基因，并以其保守区段来设计的引物是

H1：5-’ACCAAGGCGGCGAGGAAGA-3’；

H2：5’-TCGAAGAGGCCGACGAGGTAG-3’

本发明所采用的病原真菌菌体保守基因序列为绿僵菌管蛋白基因，并以其保守区段来设计的引物是

T3：5’-AGCCGACCATGAAGAAGTGC-3’，

T4：5’-TGCCTCCAGGGTTTCCAGAT-3’

当然本发明的监控过程中，也可用其他保守序列作为监控序列，但需要注意的是，在所选的这两段序列中，不能含有相似的片段，而且根据这两段序列可设计出比较特异的引物，在供试的样本中只能扩增出单一目的带。