[发明专利]获得抗体的方法

说明书

技术领域

本发明涉及用于增加功能重组抗体，且特别是治疗抗体的生产或分离产率的方法。这些方法特别适合于大规模工业化生产治疗抗体。

背景技术

重组DNA技术已经快速发展并且特别适用于生产抗体，特别是治疗抗体。所述用于表达重组基因的系统为本领域技术人员众所周知的。它们包括在哺乳动物细胞、昆虫细胞、真菌细胞、细菌细胞和转基因动物和植物中表达。表达系统的选择依赖于编码的蛋白质的特征，例如翻译后修饰。其它考虑包括时间且特别是生产理想品质的所需量的物质所涉及的成本。后面这些考虑在生产管理部门批准所需的品质和治疗大量患者所需用量的治疗抗体中是特别重要的。

用于生产重组蛋白的最广泛使用的系统基于在大肠埃希氏杆菌(Escherichiacoli)(大肠杆菌(E.coli))中的表达。使用大肠杆菌遇到的具体问题在于在生产疗法所需用量的所需品质的物质中的困难。特别地，可能因涉及的时间和成本而令人望而却步。值得注意的一个具体的问题在于在从大肠杆菌中提取抗体的过程中在抗体的产率方面蒙受的损失。部分解决这后一种问题并且能够生产对治疗应用而言可接受的抗体的方法描述在US5,655,866中。该方法包括使用热处理以便有利于随后从非功能抗体中分离抗体的功能Fab′片段，其中的热处理可以在发酵或培养过程中的任何时间或在抗体的提取和纯化过程中的任何阶段进行。在高于室温的升高的温度下，功能抗体明显稳定，而许多其它蛋白质，包括宿主细胞蛋白质和抗体的游离轻链和重链种类或非功能片段，形成沉淀物和/或聚集物，后者易于在初步纯化操作步骤，诸如过滤或离心或流化床色谱过程中从功能抗体中得到分离。尽管按比例来说，纯化成本为治疗抗体产物的总成本的一部分，但是纯化成本的比例在上游生产成本变得低廉时会进一步增加。因此，抗体的回收和纯化方面的改善会驱使生产成本进一步下降，而与生产方式无关(Humphreys & Glover，Curr.Opin.Drug Discovery &Development，2001，4：172-185)。因此，例如，对通过增加产物收率和/或改善产物流的品质将时间和/或成本节约引入治疗抗体生产且特别是纯化中的方法存在需求。

每次发酵或培养中的低产率通常是初步提取阶段时注意到的具体问题；抗体的表达在细胞内较高，但在初步提取阶段时的高回收百分比明显难以获得。US5,665,866中描述了通过包括热处理步骤提高初始纯化产率，所述的热处理步骤通过除去非功能抗体而有助于纯化过程。

WO2005019466(本申请的优先权日后公开的)中描述了通过在发酵后而在下游加工前包括中断步骤增加重组蛋白的产率。

发明内容

本文所述的本发明基于令人惊奇或出人意外的观察结果，即将非裂解处理与热处理联用使得初步提取阶段时功能抗体的产率增加达到50％，即使得功能抗体的产率高于单独采用热处理时的产率。这能够非常有益地节约治疗品质的功能抗体量的生产时间和成本。

因此，提供了用于生产重组抗体分子的方法，包括培养用编码重组抗体分子的表达载体转化的宿主细胞样品并且对所述的样品进行非裂解处理步骤。

在一个优选的实例中，重组抗体分子为至少部分抗体轻链和至少部分抗体重链，使得所表达的轻链和重链抗体分子中的至少某些能够组合成功能抗体。

在一个最优选的实施方案中，该方法进一步包括使样品经历30℃-70℃范围内的温度增加长达24小时。因此，本发明还提供了增加从包含功能抗体分子和非功能抗体分子的样品中分离的功能抗体分子的产率的方法，该方法包括使样品经历30℃-70℃范围内的温度增加长达24小时，其中使样品在经历温度增加前经历非裂解处理步骤。因此，使用本发明的方法可以实现分离或获得的功能抗体的产率增加。

特别地，该方法能够在可以根据需要或本领域技术人员可以理解的温度范围和处理条件下增加分离的功能抗体的产率，从而考虑到了产生的功能抗体和所用的表达系统的特定特征。

本文所用的“功能抗体”包括保持特异性识别或结合它们产生所针对的抗原(关联抗原)的抗体分子。根据相当于预计的抗体分子量的非还原SDS-PAGE上单一带的存在或通过使用BIACore的直接结合测定法或本领域技术人员已知的其它方法，例如但不限于ELISA证实功能抗体的产生。非功能抗体包括无法识别其关联抗原的片段，并且包括不正确折叠或不正确装配的抗体、游离重链和轻链及其片段，包括无法识别或结合其关联抗原的部分降解的抗体片段。