[发明专利]肽的环化

说明书

本发明涉及环肽的合成，所述环肽包含由一个氨基酸残基侧链的羧基和第二个氨基酸残基侧链的氨基闭合形成的环。

已经描述过肽的树脂上环化(on-resin cyclisation)，所述环化是通过在氨基酸侧链的ω-羧基(即与碳链长度无关的侧链上的羧基)，通常是天冬氨酰基或谷氨酰基残基，和氨基酸侧链的ω-氨基(即与碳链长度无关的侧链上的氨基)，通常是赖氨酸残基，之间形成内酰胺。

Rijkers等(An optimized solid phase strategy-including on-resin lactamization-ofAstressin，its retro-，inverso-and retro-inverso isomers，2002，Biopolymers 63，141-149)描述了Boc-保护的41-聚体在Rink酰胺树脂上的内酰胺化作用。30位(Glu)和33位(Lys)在Pd(0)催化的除去烯丙基和alloc保护基的一个步骤中被去保护，随后在存在BOP/HOBt和Hünig碱时在N-甲基吡咯烷酮中环化。用标准正交保护法(orthogonalprotection scheme)采用FMOC合成肽，但最后一个被Boc保护的残基除外。随后，通过TFA酸处理除去N-末端Boc保护基，然后从树脂上释放该肽。

这种方法的缺点在于，终止合成全长肽是肽区段随后环化的预先要求。由于不希望的侧链反应(形成焦谷氨酸盐)或者烯丙基/alloc不完全去保护，因此会造成非常有价值的全长肽损失。此外，在树脂上使用酸不稳定的保护基并不总是理想的，因为这会防止肽在树脂上随后进一步衍生，例如，乙酰化或封闭N-末端。其N-末端乙酰化之前不可以进行任何反应，因为这会使末端Nα易于在手性Cα上差向异构(epimerisation)。

Kates等(《固相合成环肽的一种新型方便的三维正交方法》(A novel，convenientthree dimensional orthogonal strategy for solid-phase synthesis of cyclic peptides)，1993，Tetrahedron Letters 34：1549-1552)描述了通过将C-末端天冬氨酰基或谷氨酰基残基侧链锚定于其Cα残基受被烯丙基酯保护基保护的不同树脂手柄(resin handle)上而从头到尾环化十聚肽。对完整肽链进行线形固相FMOC合成之后，通过Pd催化除去烯丙基酯部分，然后除去Nα-FMOC序列并随后进行BOP/HOBt/DIEA介导的头-尾环化。有趣的是，我们发现该方案在不存在FMOC保护基时将去保护的C-末端天冬氨酰基残基(将FMOC-Asp偶联到PAL树脂手柄而构成的Asn⁸)偶联于脱去N-末端天冬氨酰基残基的Nα比沿环肽序列改变合成起点的其它合成方案更加有效。

该方法的有限缺点在于，它未考虑主要的烯丙基去保护步骤中作为副反应发生的部分FMOC去保护，这是由于存在亲核试剂且由于它不能确实影响反应方案。随后在任何事件中进一步完成FMOC去保护，且这是随后进行头-尾肽结合所必需的。相反，仅通过肽侧链官能团的内酰胺化作用进行环化主要取决于保持Nα的完全保护。

Blankemeyer等(1988，Tetrahedron Lett.29，5871-5874)描述了在含有4-(4’-甲氧基三苯甲氧基)-丁-2-烯氧基-己酸作为固相的烯丙型手柄的纤维素盘上合成一些保护的肽片段，合成还采用了FMOC化学。用无水THF中的Pd(PPh₃)₄进行处理随后加入HOBt的THF溶液以清除烯丙基酯接头(linker)。

本发明发明了另一种环化肽侧链的方法，该方法避免了上述缺点，且特别适用于环化含有天冬氨酰基侧链的肽。

根据本发明，肽的环化方法包括以下步骤：

a.脱去肽的烯丙基(allyl或丙烯基)型保护基，所述肽在其Nα上用碱不稳定性保护基团保护，所述肽还包含至少一个烯丙氧基-羰基-保护的赖氨酸侧链(即ε-氨基)或该赖氨酸侧链类似物的氨基官能团，并且还包含至少一个烯丙基-酯-保护的谷氨酰基侧链(即β-羧基)或天冬氨酰基侧链(即γ-羧基)或者该侧链类似物的ω-羧基，同时保留Nα上的碱不稳定性保护基团，

b.在弱碱试剂存在下通过所述去保护侧链的内酰胺化作用使肽环化，和

c.脱去所述肽Nα上的碱不稳定性保护基团。