[发明专利]爬山虎属及近缘属中白藜芦醇芪合酶基因及其应用方法

说明书

本发明克隆了川鄂爬山虎(Parthenocissus henryana)、五叶爬山虎(Parthenocissus quinquefolia L.Planch)及菱叶粉藤(Cissus rhombifoliaPlanch)的三个长度均为1.2kb的白藜芦醇芪合酶基因(STS)全序列。三个基因的同源性甚高，达97.8％。该基因编码产物芪合酶(Stilbene synthase)催化底物丙二酰-CoA和苯丙酰-CoA合成白藜芦醇。白藜芦醇具有很多的医疗保健作用，如防止血小板凝聚、防止人体低密度脂蛋白氧化、清除自由基、消炎、抗过敏、抗肿瘤等，因此在各国引起高度重视。由于白藜芦醇的这些保健功能，它的含量高低已经成为葡糖酒质量好坏评价的一个重要指标。已经发现白藜芦醇在葡萄属及另外的一些物种中存在。实验证明可以通过转基因的途径使一些不含白藜芦醇的物种也具备合成白藜芦醇的能力，从而提高这些物种的营养保健功能。也可以通过控制植物次生代谢途径的生物反应器来生产白藜芦醇。上述三个克隆的基因，经在GenBank上检索，证实为新的基因序列。

本发明的主要创新之点在于(1)首次从爬山虎属及近缘白粉藤属中克隆白藜芦醇芪合酶基因；(2)构建了白藜芦醇芪合酶基因的植物表达载体，通过转基因的途径使一些不含白藜芦醇的物种也具备合成白藜芦醇的能力，从而提高这些物种的营养保健功能；(3)可通过强启动子的使用，提高芪合酶的表达量，促进白藜芦醇的生物合成。

白藜芦醇是植物的次生代谢产物，由芪合酶催化底物合成。天然含有芪合酶基因的植物只有在遭受环境压或病原菌攻击时，才能激发该基因的转录并转译为芪合酶，进而瞬时合成白藜芦醇。遗憾的是，绝大多数植物缺少STS基因，却含有芪合酶作用的底物。同时，白藜芦醇仅存在于少数可食食物中，且含量甚低。因此，可以通过基因工程的方法构建含STS基因的植物表达载体，再把此基因转入到不含STS的植物，或者含STS但表达量不高的植物当中去，将有可能在这些植物中获得含量较高的白藜芦醇。

本项发明的技术要点之一是从爬山虎属及近缘白粉藤属中克隆白藜芦醇芪合酶基因。从已发表的Vitis vinifera，Vitis labrusca以及Vitis ripuria的芪和酶(STS)基因序列的比较中可以看出，STS基因主要由两个外显子和一个内含子组成。这三个序列在转录开始位点和终止位点附近的的碱基序列相对较为保守，同时三个序列外显子的同源性极高。根据STS基因转录起始和终止位点附近碱基很高的保守性，我们设计了两条引物(P1、P2)，将STS全长序列从爬山虎属及近缘白粉藤属cDNA文库中克隆出来。

本项发明的要点之二是白藜芦醇芪合酶基因的植物表达载体pM3T1ΩBM3的构建。将2a12启动子置于STS基因上游，得到中间载体p7Z-T1-2a12。然后将增强型启动子35SΩ置换掉2a12启动子，得到中间载体p7Z-T1Ω。将35SΩ-T1通过ApaI+SacI双酶切放入植物表达载体p3300T1M3中，然后在插入MAR3元件，构建成植物表达载体pM3T1ΩBM3。

在本发明的一个实施方案中，我们设计了两条引物(P1、P2)，将STS全长序列从爬山虎属及近缘白粉藤属cDNA文库中克隆出来。引物序列如下：P1：5’-CGG GAT CCG CCA TGG CTT CAG TTG AGG AAT TTA G-3’P2：5’-GTG AGC TCG AAG GGT AAA CCA TTC TCT TTT AT-3’

在本发明的一个实施方案中，STS基因置于改造的组成型表达启动子CaMV35SΩ启动子的调控之下，得到中间载体p7Z-T1Ω。将35SΩ-T1通过ApaI+SacI双酶切放入植物表达载体p3300T1M3中，然后在插入MAR3元件，构建成植物表达载体pM3T1ΩBM3(见图一、爬山虎属及近缘白粉藤属中白藜芦醇芪合酶基因植物表达载体pM3T1ΩBM3的构建流程图)。

此专利涉及的菌种已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，单位地址中国北京中关村，该微生物分类名称为大肠埃希氏菌(Ecoli.)，保藏代号为pM3T1ΩBM3，保藏编号为CGMCC NO.0722，保藏日期为2002年3月8日。

                          序列表一、川鄂爬山虎STS基因序列：1       CGGGATCCGC CATGGCTTCA GTTGAGGAAT  TTAGAAACGC  TCAACGTGCC  AAGGGTCCGG61      CCACCATCCT  AGCCATTGGC  ACAGCTACTC  CCGACCAGTG  TGTCTACCAG  TCTGATTATG121     CTGATTACTA  TTTTAGGGTC  ACTAAGAGCG  AGCACATGAC  TGAGTTGAAG  AAGAAGTTCA181     ATCGCATATG  TGAAAAATCA  ATGATCAAGA  AGCGTTATAT  TCATTTGACT  GAAAAGATGC241     TTGAGGAGCA  CCCAAACATT  GGTGCTTATA  TGGCTCCATC  TCTTAACATA  CGCCAAGAGA301     TTATCACTGC  CGAGGTACCC  AAGCTTGGTA  AAGAAGCAGC  ATTGAAGGCT  CTTAAAGAGT361     GGGGTCAACC  CAAATCCAAG  ATTACCCATC  TTGTATTTTG  TACCACCTCT  GGTGTAGAAA421     TGCCTGGTGC  CGACTATAAA  CTCGCTAATC  TCTTAGGCCT  CGAAACATCT  GTTAGAAGAG481     TGATGTTGTA  TCATCAAGGT  TGCTATGCAG  GTGGAACTGT  CCTTCGAACT  GCTAAGGATC541     TTGCAGAGAA  TAATGCAGGA  GCACGAGTTC  TTGTGGTGTG  CTCTGAGATC  ACTGTTGTCA601     CATTCCGTGG  ACCTTCCGAA  ACTGCTTTGG  ACTCTTTAGT  TGGCCAAGCC  CTTTTTGGTG661     ATGGGTCTGC  AGCTGTGATC  GTTGGATCAG  ATCCAGATAT  CTCGATTGAA  CAACCACTTT721     TTCAACTCGT  CTCAGCAGCC  CAAACATTTA  TTCCTAATTC  AGCAGGTGCC  ATTGCCGGGA781     ACTTACGTGA  GGTGGGACTC  ACATTTCATT  TGTGGCCCAA  TGTGCCAACT  TTAATTTCTG841     AGAACATAGA  GAAATGCTTG  ACTCAGGCTT  TTGACCCACT  TGGTATTAGC  GATTGGAACT901     CGTTATTTTG  GATTGCTCAC  CCAGGTGGCC  CTGCAATTCT  TGATGCGGTT  GAAGCAAAAC961     TCAATTTAGA  CAAAAAGAAA  CTTGAAGCAA  CGAGGCATGT  GTTAAGTGAG  TATGGCAACA1021    TGTCAAGTGC  ATGTGTGTTG  TTTATTTTGG  ATGAGATGAG  AAAGAAATCA  CTTAAGGGGG1081    AGAAGGCCAC  CACAGGTGAA  GGATTGGATT  GGGGAGTATT  ATTTGGCTTT  GGATCAGGCT1141    TGACTATTGA  GACTGTTGTG  TTGCATAGCA  TTCCTATGGT  TACAAATTAA  ATAAAAGAGA1201    ATGGTTTACC  CTTCGAGCTC  ACAATCAC二、菱叶粉藤STS基因序列：1       CGGGATCCGC CATGGCTTCA GTTGAGGAAT  TTAGAAACGC  TCAACGTGCC  AAGGGTCCAG61      CTACCATCCT  AGCCATTGGC  ACAGCTACTC  CCGATCAGTG  TGTCTACCAG  TCTGATTATG121     CTGATTACTA  TTTCCGGGTC  ACTAAGAGCG  AGCACATGAC  TGAGTTGAAG  AAGAAGTTCA181     ATCGCATATG  TGAGAAATCA  ATGATCAAGA  AGCGTTACAG  TCATTTGACC  GAAGAAATGC241     TCGAGGAGCA  CCCAAACATT  GGTGCTTATA  TGGCTCCATC  TCTTAACATA  CGCCAAGAGA301     TTATCACTGC  TGAGGTACCT  AAGCTTGGTA  AGGAAGCAGC  ATTGAAGGCT  CTAAAAGAGT361     GGGGCCAGCC  AAAGTCCAAG  ATCACCCATC  TTGTATTTTG  TACAACCTCC  GGTGTAGAAA421     TGCCTGGTGC  AGATTACAAA  CTCGCTAATC  TCTTAGGGCT  TGAAACATCG  GTCAGAAGAG481     TGATGTTGTA  CCATCAAGGG  TGCTATGCAG  GTGGAACTGT  CCTCCGAACT  GCTAAGGATC541     TTGCAGAGAA  TAATGCAGGA  GCACGAGTTC  TTGTGGTGTG  CTCTGAAATC  ACTGTTGTTA601     CATTCCGTGG  GCCTTCTGAA  ACCGCTTTGG  ACTCTTTAGT  TGGTCAAGCC  CTTTTTGGTG661     ATGGGTCTGC  AGCTGTGATC  GTTGGATCAG  ATCCAGATAT  CTTGATTGAA  CGACCGCTCT721     TCCAACTCGT  CTCAGCAGCC  CAAACATTTA  TTCCTAATTC  AGCAGGTGCC  ATTGCCGGGA781     ACTTACGTGA  GGTGGGACTC  ACCTTCCATT  TGTGGCCCAA  TGTGCCTACT  TTAATTTCTG841     AGAACATAGA  GAAATGCTTG  ACTCAGGCTT  TTGACCCACT  TGGTATTAGC  GATTGGAACT901     CGTTATTTTG  GATTGCTCAC  CCAGGTGGTC  CAGCTATTCT  TGACGCGGTT  GAAGCAAAAC961     TCAGTTTAGA  TAAACAAAAA  CTCGAAGCAA  CGAGGCATGT  GCTAAGTGAG  TATGGCAACA1021    TGTCAAGTGC  ATGTGTGTTG  TTTATTTTGG  ATGAGATGAG  AAAAAAATCC  CTTAAGGGGG1081    AGAAGGCCAC  CACAGGTGAA  GGATTGGATT  GGGGAGTATT  ATTCGGTTTT  GGCCCAGGTT1141    TGACTATTGA  GACTGTTGTG  TTGCATAGCA  TTCCTATGGT  TACAAATTAA  GTGAAATAAA1201    AGAGAATGGT  TTACCCTTCG  AGCTCACAAT  CAC三、五叶爬山虎STS基因序列：1       TGGGATCCGC CATGGCTTCA GTTGAGGAAT  TTAGAAACGC  TCAACGTGCA  AAGGGTCCAG61      CCACCATCCT  AGCCATTGGC  ACAGCTACTC  CCGACAACTG  TGTCTATCAG  TCAGATTATG121     CTGATTTCTA  CTTCAGGGTC  ACTAAGAGCG  AGCACATGAC  TGAGTTGAAG  AAGAAGTTCA181     ATCGCATATG  TGAGAAATCA  ATGATCAAGA  AGCGTTACAG  TCATTTGACC  GAAGAAATGC241     TCGAGGAGCA  CCCAAACATT  GGTGCTTATA  TGGCTCCATC  TCTTAACATA  CGCCAAGAGA301     TTATCACTGC  TGAGGTACCT  AAGCTTGGTA  AGGAAGCAGC  ATTGAAGGCT  CTAAAAGAGT361     GGGGCCAGCC  AAAGTCCAAG  ATCACCCATC  TTGTATTTTG  TACAACCTCC  GGTGTAGAAA421     TGCCTGGTGC  AGATTACAAA  CTCGCTAATC  TCTTAGGGCT  TGAAACATCG  GTCAGAAGAG481     TGATGTTGTA  CCATCAAGGG  TGCTATGCAG  GTGGAACTGT  CCTCCGAACT  GCTAAGGATC541     TTGCAGAGAA  TAATGCAGGA  GCACGAGTTC  TTGTGGTGTG  CTCTGTAATC  ACTGTTGTTA601     CATTCCGTGG  GCCTTCTGAA  ACCGCTTTGG  ACTCTTTAGT  TGGTCAAGCC  CTTTTTGGTG661     ATGGGTCTGC  AGCTGTGATC  GTTGGATCAG  ATCCAGATAT  CTTGATTGAA  CGACCGCTCT721     TCCAACTCGT  CTCAGCAGCC  CAAACATTTA  TTCCTAATTC  AGCAGGTGCC  ATTGCCGGGA781     ACTTACGTGA  GGTGGGACTC  ACCTTCCATT  TGTGGCCCAA  TGTGCCTACT  TTAATTTCTG841     AGAACGTAGA  GAAATGCTTG  ACTCAGGCTT  TTGACCCACT  TGGTATTAGC  GATTGGAACT901     CGTTATTTTG  GATTGCTCAC  CCAGGTGGTC  CAGCTATTCT  TGACGCGGTT  GAAGCAAAAC961     TCAGTTTAGA  TAAACAAAAA  CTCGAAGCAA  CGAGGCATGT  GCTAAGTGAG  TATGGCAACA1021    TGTCAAGTGC  ATGTGTGTTG  TTTATTTTGG  ATGAGATGAG  AAAAAAATCC  CTTAAGGGGG1081    AGAAGGCCAC  CACAGGTGAA  GGATTGGATA  GGGGAGTATT  ATTCGGTTTT  GGCCCAGGTT1141    TGACTATTGA  GACTGTTGTG  TTGCATAGCA  TTCCTATGGT  TACAAATTAA  GTGAAATAAA1201    AGAGAATGGT  TTACCCTTCG  AGCTCACAAT  CAC