[发明专利]针对活性肝生长因子激活剂的特异抗体和应用该抗体的方法

说明书

                   发明背景

发明所属技术领域

本发明涉及用于特异地检测活性肝细胞生长因子激活剂(HGFA)的抗体或单克隆抗体，应用该抗体的方法和检测试剂盒。本发明还涉及用活性的HGFA作为指示以检测具有病理症状患者的疾病，特别是器官炎症，肾小球肾炎，癌症，心绞痛，心肌梗塞或血栓溶解的方法，并进一步涉及收集适宜实施该方法的生物组分和血液的方法。

背景技术介绍

蛋白酶(蛋白分解酶)是具有水解蛋白或肽中的肽键的功能的蛋白，其与有机体的功能密切相关，同时对维持其内环境的稳定起着重要的作用。例如存在于血液中的多种蛋白酶本身构成密集的级联体控制凝血和血液中纤维蛋白溶解作用。

已知肝生长因子激活剂(此后简写为“HGFA”)是一种丝氨酸蛋白酶，在其活性中心有一丝氨酸残基(Miyazawa等人.，生物化学杂志，268，pp.10024-10028，1993)。与包含于凝血/纤维蛋白溶解作用系统级联体中的一般血液蛋白酶不同，HGFA具有作用于肝生长因子(此后简写为“HGF”)的独有特性，已知肝生长因子是与肝细胞生长或器官再生相关的细胞因子(Naka等人，生物化学杂志267，pp.20114-20119，1992)，HGFA特异地且有限地分解HGF并由此激活它(Shimomura等人.，细胞技术，8，pp.219-229(1992))。但是，对于HGFA的作用，仅在用大鼠进行的动物模型实验或体外实验(Miyazawa等人.，生物化学杂志，271，pp3615-3618，1996)中其对HGF的激活作用是已知的，HGFA在人病理条件下的作用和功能，以及其在血液中的水平与病理学症状之间的关系都不清楚。

对于HGFA，已知其中一个由SDS-PAGE确定的分子量约为96,000-98,000(此后简写为“98kDa HGFA”)，一个是分子量约为34,000-38,000(此后简写为“36kDa HGFA”)，后者是对该蛋白从翻译起始氨基酸起算第372位的精氨酸和第373位的缬氨酸之间的键进行有限的蛋白水解而得到的位于该蛋白C末端一侧的肽。分子量的变化是由糖链结合量的异质性引起的，而所测得的分子量的数值上的差异是由于SDS-PAGE测定是分别在还原或非还原条件下进行而造成的，它们实质上是相同的蛋白。而且，每一HGFA通常是作为非活性底物存在于血液中，但对其在从翻译起始氨基酸起算第407位的精氨酸和第408位的异亮氨酸之间的键进行有限的蛋白水解，可将其激活，从而使单链的HGFA转化成由二硫键异源二聚体化的双链HGFA。据认为这一激活的HGFA可以特异地激活底物HGF(Shimomura等人.，生物化学杂志.，268，pp.22927-22932，1993)。

为分析HGFA血液水平和病理学症状之间的关系，存在于生物组分如人体组织，体液或血液中的活性HGFA需经特异地测定。而且为特异地检测或测定活性HGFA，必须获得一种抗体，特别优选的极为特异地识别活性的HGFA，而基本上不识别非活性的HGFA单克隆抗体。但任何具有此种特性的抗体至今未见报道。而且，没有特异地用于检测存在于生物组分，如人体血液中的活性HGFA的方法或试剂盒。

                                   发明概述

据此，本发明的一个目的是提供一种抗体，其可特异地识别活性的HGFA，而基本上不识别非活性的HGFA，一种应用上述抗体检测活性HGFA的方法，以及检测与活性HGFA相关疾病的方法和试剂盒。

本发明的发明人构建了一个对血液中的HGFA进行定量的系统，用以分析血液中HGFA的水平和有关人体病理学症状的多种人类疾病之间的关系。首先，他们用已知的针对HGFA的现有的鼠单克隆抗体7E10，P1-4，A-1，A-6，A-23，A-32，A-51，A-75通过双抗夹层方法(酶联免疫吸附分析，此后简写为“ELISA检测系统”)构建了酶标抗体检测系统(Miyazawa等人.，生物化学杂志.，271，pp 3615-3618，1996)。而且，他们分析了在健康的供试者和具有多种疾病，包括器官疾病的患者血液(血浆和血清)中HGFA单克隆抗体的反应性。但是用这些单克隆抗体通过ELISA检测系统检测，发现在包括正常供试者在内的所有人体血样中都呈现出一致的强反应性，而没有对人类疾病特异的反应性，也就是说，没有检测到HGFA血液水平标志性的变化。因此，本发明的发明人分析了目前存在的针对HGFA的单克隆抗体的对HGFA反应性，以探究其中原因。