[发明专利]在原核细胞内产生活性异二聚体AMV－RT的方法

说明书

                      技术领域

本发明涉及一种产生重组的活性异二聚体AMV-RT的方法，是通过在某些生长和诱导条件下在原核细胞内表达编码AMV-RTα-和/或β-亚单位的一种或几种DNA序列。

                      背景技术

二十世纪七十年代发现了逆转录酶，推翻了关于从DNA经过RNA至蛋白质作为单向性过程信息传递的分子生物学“中心法则”(TerminH和Mizutani S.，1970，自然，226：1211-1213；Baltimore D.，1970，自然，226：1209-1211)。对这些RNA-依赖性DNA聚合酶的催化特征鉴定是现代理解RNA病毒增殖周期的基础，因此也是理解由这种类型病毒引起的疾病(癌症、艾滋病等)发展和传播的基础。

但是，对于cDNA的合成、扩增和克隆(RT-PCR)逆转录酶也是一种分子生物学工具。这种技术使之有可能简化和加速对真核细胞内基因表达的测定。从细胞提取物或组织分离出总mRNA之后，借助于逆转录酶将此mRNA回译成cDNA，并通过随后的PCR步骤扩增，以便能够进行克隆和特征鉴定。因而，一方面是不必阐明基因内含子和外显子的结构，但另一方面是在细胞的不同生命周期中或者在疾病(如癌症)的发展过程中也可能测定细胞内基因的表达。

迄今已仔细地测定了来自三种不同逆转录病毒的逆转染酶(RT)：来自Moloney氏鼠白血病病毒(M-MLV)的RT，此酶由具有78kD分子量的单一亚单位组成(Prasad V.R.，1993逆转录酶述评，冷泉港，纽约：冷泉港实验室出版社，135)。此外还已知一个来自人免疫缺损病毒(HIV)的RT。此RT是由二个亚单位p66和p51组成的异二聚体，p51亚单位是由p66蛋白水解断裂而形成(Le Grice S.F.J.，1993逆转录酶述评，冷泉港，纽约：冷泉港实验室出版社，163)。此外还已知来自鸟肉瘤-白血病病毒(ASLV)的RTs。可从鸟成骨髓细胞白血病病毒(AMV)获得的RT也属于ASLV家族。这种RT也是一种异二聚体，由具有分子量大约63kDa的α-链和具有分子量大约95kDa的β-链组成。在此情况下，α-链也是由β-链的蛋白水解加工而形成(Golomb M和Grandgenett D.，1979，生物化学杂志，254：1606-1613；Weiss R.等编著，1984，肿瘤病毒的分子生物学，第二版：RNA肿瘤病毒l/text。冷泉港实验室，冷泉港，纽约)。

虽然M-MLV-RT是在大肠杆菌中作为单体被表达，HIV-RT是作为异二聚体被表达，但是迄今还不可能在大肠杆菌或其它原核生物内满意地表达AMV-RT作为有活性的或可溶性异二聚体。尽管按照WO 00/42199，在大肠杆菌或优选地在昆虫真核细胞内表达了某些RT变异体，但是，按此方法获得的所需RT主要(大约90％)由不溶性成分组成。

此外，在大肠杆菌细胞粗提取物中也难以测定重组AMV-RT，一方面是因为RNA模板可被大肠杆菌固有的RNA酶降解，另一方面是因为大肠杆菌菌株具有DNA聚合酶，此酶除了具有DNA聚合酶活性外还具有RT活性(Ricchetti，M.和Huc，H.，1993，EMBO杂志，12(2)，387-396)。因此，大肠杆菌这种固有的RT活性会明显地干扰对大肠杆菌粗提取物内和纯化组分内重组AMV-RT活性的测定。

因此，本发明的目标是提供足够量的活性的重组异二聚体AMV-RT。

                       发明概述

是通过在原核生物宿主细胞内产生活性异二聚体AMV-RT的方法来实现此目标，其中是将编码AMV-RTα和β亚单位或链的一种或几种DNA序列克隆进入表达质粒，然后将此质粒转化进入原核细胞，诱导表达此异二聚体AMV-RT，并从细胞内纯化，即分离出这种重组异二聚体AMV-RT。其中适合的基因和DNA序列是仅编码一种AMV-RT亚单位的序列。随后可以借助于某些方法如蛋白水解切割β-链，将此表达产物的一部分转变成其它的亚单位。已证明序列SEQ IDNO：4和SEQ ID NO：5特别适合于本发明的方法，它们可产生由亚单位SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7组成的活性异二聚体AMV-RT。

                      发明内容