[发明专利]人重组软骨寡聚基质蛋白的纯化与应用

说明书

透明软骨是一种特殊的结缔组织，其在关节分散负荷中起重要作用。其提供了光滑，低摩擦力的滑动表面，对压力和冲击力有缓冲和抵抗作用。它由包埋在由细胞自身产生，合成及供养的胞外基质中的终末分化的软骨细胞组成。软骨的胞外基质由三类分子组成。第一类是高度交联的三螺旋II型胶原纤维，其与其它软骨特异的胶原包括XI型和IX型胶原相互作用。第二类包括丰富的大聚集的聚集蛋白聚糖以及一些小蛋白聚糖如双链蛋白聚糖和核心蛋白聚糖。这些蛋白聚糖含有硫酸软骨素作为它们的糖胺聚糖侧链。第三类蛋白质是非胶原蛋白，包括软骨寡聚基质蛋白(COMP；有时也称为钙结合糖蛋白-5)和连接蛋白。软骨胞外基质的合适组成和排列对基质中保留适当水分和电解质，从而赋予其机械性能是非常重要的。表面上软骨是稳定的并能耐受巨大的物理应力，但软骨可被各种机械性，化学性和微生物因子破坏，通常导致疼痛，肿胀，活动丧失，及最后导致伤残性关节炎。软骨的最大限制是其不能愈合。这种固有的不能修复性是由于其没有血管，软骨细胞的固定性，及成熟软骨细胞对增殖和改变其合成模式的限制性所致。已经使用的各种刺激软骨修复的方法取得不同程度的成功。治疗骨关节炎的主要外科方法包括组织移植，软骨细胞和间充质干细胞移植，及移植人工基质包括胶原凝胶，碳纤维垫，和多孔聚乳酸和其它可生物降解的合成基质。由于可用于移植的软骨组织的来源有限，治疗努力主要集中于移植细胞和基质，以产生在结构及生物化学和机械性能上类似于关节软骨的再生组织。然而，尽管许多研究实验室和公司作了大量努力，这些方法的成果通常是混杂的，且不是非常令人满意的。需要研究出一种更有效的软骨修复的方法。

重组人软骨寡聚基质蛋白(COMP)在哺乳动物系统中已经产生并纯化。此纯化的人COMP比先前报道的纯化的COMP有更多的优点。人COMP以钙充满(calcium replete)构象纯化，其维持了3型钙结合重复序列的结构与功能，并从而维持蛋白质的天然结构与功能。人COMP是一种糖胺聚糖(GAG)结合蛋白。它与GAG如肝素和硫酸软骨素结合。硫酸软骨素是软骨中发现的蛋白聚糖的主要成分。肝素结合性还提供了一种从条件培养基中纯化人COMP的非常便利的方式。这与先前在存在EDTA情况下纯化的COMP不能与肝素结合的报道相反。人COMP被证实在钙充满的形式下具有与GAG更好的亲和力。COMP被证实毫无疑问是软骨细胞的粘着蛋白，无论软骨细胞是分化的还是未分化的。数据还表明COMP需要在钙充满形式下使其细胞粘着活性最大。COMP还示出作为能动因子促进软骨细胞迁移。COMP的这些性质，与其结合胶原，及分化调节试剂视黄酸和维生素D₃及其代谢物的能力，使COMP成为用于软骨修复研究中的非常好的引诱剂。COMP可用于软骨修复中软骨细胞移植和人工基质移植，依靠的是COMP能作为细胞的化学引诱物和粘着底物，并作为输送视黄酸和维生素D₃及其代谢物的试剂，促进和维持软骨细胞分化及正确软骨基质的产生。

本发明包括纯化的CMOP，如人COMP(hCOMP)，包括通过在存在钙的情况下表达和/或纯化hCOMP而制备的hCOMP，本发明还包括在存在钙的情况下纯化COMP(如hCOMP)的方法。COMP可在钙充满的环境中纯化，例如钙以毫摩尔范围(水平)存在，如至少300μM(0.3毫摩尔)。在一实施方案中，将hCOMP导入例如能表达及分泌hCOMP的细胞中，培养细胞，如在适于表达hCOMP的条件下在培养基中培养；并在存在钙的情况下纯化hCOMP。hCOMP克隆可通过用编码全长hCOMP的DNA(“hCOMP DNA)(Newton等，1994)转染合适细胞而产生。hCOMP可在钙充满条件下例如毫摩尔水平(即在毫摩尔范围)下纯化。细胞可在钙充满培养基中培养。hCOMP可在特征在于钙浓度至少为300μM的环境(如溶液)中表达和/或纯化。能表达COMP的细胞包括某些成纤维细胞，软骨细胞，肌腱，韧带，平滑肌细胞，周细胞和人胚肾细胞，或用编码COMP的DNA转染的其它细胞。

在一个实施方案中，通过本发明方法生产的hCOMP当被胰蛋白酶酶解时，消化为50kDa或55kDa的条带。在另一实施方案中，纯化的hCOMP可被胰蛋白酶消化为62kDa或67kDa的条带。

本发明也包括COMP(例如人COMP，如由本发明方法纯化的hCOMP)的片段，突变体和其它衍生物和类似物，以及生产和使用这种片段，突变体和其它衍生物和类似物的方法。在一个实施方案中，这种衍生物包括COMP的，尤其钙充满构象中的COMP的结合位点(如钙结合位点)。本发明还涉及包括COMP和/或COMP衍生物的组合物。