[发明专利]肝癌细胞特异的基因工程腺病毒的构建及应用

说明书

本发明涉及一种肝癌细胞特异的基因工程腺病毒的构建及应用。

腺病毒是一种双链DNA病毒。除了引起呼吸道疾病及象感冒症状之外，至今未发现腺病毒引起其它严重疾病。腺病毒的基因组有36000左右碱基对。编码的基因分为早期基因和晚期基因。早期基因当中除了基因组3之外，其它基因都是病毒复制繁殖所必需的。象基因组E1，E2和E4缺失的病毒变种在一般细胞中是不会复制繁殖的(Shenk T.，Fundamantal Virology，Third Edition，979-1005，1996)。现在常用的腺病毒载体，都是复制缺陷型(Replication-deficient)。由于腺病毒基因组的基因表达调控已研究得较清楚，同时腺病毒可以感染各种类型的细胞，不会引起严重疾病，不会整合到染色体中去，腺病毒很稳定且易生产。因此腺病毒被认为可发展成具有巨大应用潜力的基因治疗的载体。

早在上世纪50年代，腺病毒就被科学家用来尝试治疗肿瘤。美国国家卫生研究院的Smith博士等人尝试利用野生型的腺病毒治疗子宫癌(Smith et.al.，Cancer 9：1211-1218，1956)。他们把腺病毒直接注射到原位子宫肿瘤中，发现65％的病人表现出疗效。同时没有一位病人出现任何副作用(Smith et.al.，Cancer 9：1211-1218，1956)。可惜的是由于当时病毒纯化技术的落后和子宫肿瘤注射操作的困难，使得这项试验没有进展下去。

直到1996年，美国的ONYX制药公司，采用基因工程技术，将早期基因EIB当中的p55K编码区切除而改造成一种倾向于在p53肿瘤细胞缺陷的肿瘤细胞中复制的腺病毒变种：dl1520(Barker and Berk，Virology 156：107-121，1987)。这种病毒在p53缺陷的细胞中复制效率比在p53正常的细胞中要高100倍(Bischoff et.al.，Science 274：373-376，1996)。但由于p55K蛋白的功能除了与p53结合而使p53失去活性的功能之外，还参与病毒信使RNA在细胞核和细胞质之间的运输。由于p55蛋白的缺失而严重影响到病毒mRNA的转运，以致dl1520的复制能力比野生型腺病毒要低成千上万倍(Babiss et.al.，Mol.Cell.Biol.52551-2558，1985)。这严重影响到它杀死肿瘤细胞的能力。

1997，美国另一家生物制药公司—Calydon提出利用组织特异基因激活子去控制腺病毒的复制。他们成功地将人体前列腺细胞专一的抗原基因(PSA)的激活子和增强子放到腺病毒的早期基因EIA的激活子和编码区之间，产生的基因工程病毒CN706在PSΛ+细胞中的复制水平比PSΛ-细胞中要高100倍(Rodrigucz et.al.，Cancer Research 57：2559-2563，1997)。随后，另一家生物公司利用类似技术生产出倾向于在甲胎球蛋白质表达的细胞中复制的腺病毒变种(Avela041).他们将甲胎球蛋白(AFP)的激活子和增强子放到腺病毒早期基因IA的编码区上面，取代EIA基因的激活子。早期基因EIB仍然由野生的EIB自己的激活子控制。这种变种在AFP+细胞中比在AFP-细胞中复制水平要高100至1000倍。动物试验表明，这种变种能使AFP+肿瘤生长放缓(Halleubeck et.al.，Human Gene Therapy10：1721-1733，1999)。但上述的几种基因工程在肝脏肿瘤细胞中的复制特异性不高，杀死肿瘤细胞的能力还有待进一步提高。