[发明专利]抗人卵巢癌抗人CD3双特异性抗体

说明书

本发明涉及抗癌基因工程双特异性抗体，表达该双特异性抗体的核苷酸序列，含有该核苷酸序列的载体，含有该载体的宿主细胞。

双特异性抗体(BsAb)，为非天然抗体，其两个抗原结合部位具有不同的特异性，因此，化学结构上是双价的，结合抗原的功能是单价的。将肿瘤相关抗原特异的抗体与具杀伤肿瘤细胞功能的效应细胞的表面触发分子特异的抗体偶联构成的双特异性抗体，可高效地将体内的免疫效应细胞富集于肿瘤细胞周围，激活免疫效应细胞特异性地杀伤肿瘤细胞，从而起到治疗肿瘤的目的。目前双特异性抗体的制备有化学偶联法，杂交瘤法和基因工程法三种。化学偶联法是先采用还原剂，使不同的两种单克隆抗体或其片段解链，获得单价抗体或抗体片段，再采用异双功能交联剂把两种具有不同抗原特异性的单价抗体或其片段交联在一起。该方法可快速，大量制备BsAb，但是在交联过程中抗体时有失活，而且难于保证产物的均质性。杂交瘤法是通过细胞融合的方法，将分泌其中一种单克隆抗体的杂交瘤细胞与经另一种抗原免疫的脾细胞融合，或两种分泌不同单克隆抗体的杂交瘤细胞彼此融合。融合而成的细胞，前者称三体瘤，后者称四体瘤，两者统称二次杂交瘤。杂交瘤方法制备的BsAb生物活性高，但制备繁琐，耗时长，且不易与同时产生的其他没有活性或不需要的抗体分离。此外，人源杂交瘤技术尚未取得突破性进展，该法获得的BsAb在临床应用上面临产生人抗鼠抗体(HAMA)问题和分子量过大的问题，且用该方法制备临床级的BsAb成本很高，难以普及使用。基因工程法制备BsAb是随着基因工程抗体技术的发展，在小分子抗体的基础上发展起来的，有其明显的优越性，如方法稳定，可大量生产，且成本大大降低，操作简便等，正逐步取代化学偶联法和二次杂交法。随着基因工程技术的成熟，用不同的方法可将两种不同的单链抗体(ScFv)连接构成小分子的BsAb。根据连接方法不同有三种BsAb的构成形式。(1)Mini-antibody：利用一个寡聚化的结构域(例如，Fos或Jun亮氨酸拉链)将两个ScFv组装成一个异二聚体的分子。(2)Diabodies：将两个不同抗体的V_H和V_L用一个短的连接肽(例如，Gly4Ser)连接成两条不同的单链：V_H1-V_L2和V_H2-V_L1，在同一个细胞中共表达，由于短的连接肽使得同一条链的VH和VL难以配对，而仅与另外一条链的、但实际上却是来源相同的V区相匹配，折叠形成一个具有两个抗原结合位点的二聚体分子。(3)ScBsAb：在同一个载体上将两种特异性的scFv用一个域间连接肽(interlinker)相连构成，其中构成两个scFv的链内连接肽(intralinker)常用的是(Gly₄Ser)₃，而连接两个scFv的域间连接肽有两种设计，一种为短的肽链，一般不超过10个氨基酸残基，常用的是Gly₄Ser，这种设计主要目的是防止异源可变区之间的错配。另一种设计方案为长的肽链，本实验室在采用Gruber在构建抗TCR×抗荧光的scBsAb中设计了一个长25aa的域间连接肽205c’的同时，也分别设计了经改造的长26aa的Fc片段和长25aa的HSA片段作为域间连接肽，结果均显示其同样可使两个scFv产生正确的蛋白折叠而形成两个具有较强抗原结合活性位点的BsAb。域间连接肽设计总的原则是保证抗体可变区结构域发生正确的配对和折叠并保持其生物学活性及稳定性，其次还可根据需要赋予产物一些新的特性，如便于纯化、增强其在体内的半衰期等。