[发明专利]家蚕基因工程植酸酶制剂后加工处理工艺方法

说明书

本发明属于转基因物质，尤其是畜禽用转基因酶制剂制造领域。

中国专利CN99103564公开了一种应用重组BmNPV载体-家蚕宿主表达系统生产植酸酶的基因工程方法，用植酸酶基因替换家蚕核型多角体病毒基因组中的多角体蛋白基因，并使其处于多角体蛋白基因启动子的控制下，再将此重组质粒与野生型BmNPV-DNA共转染于家蚕细胞，通过体内同源重组得到带有外源植酸酶基因的重组病毒，再利用多角体蛋白基因的启动子启动植酸酶基因，并将此重组家蚕核型多角体感染家蚕，在蚕体内繁殖产生目标物植酸酶蛋白。但如何将家蚕基因工程植酸酶生产在较大的工业化程度上实现，或者更具体地说在畜禽用转基因酶制剂工业中批量化、低成本生产出具有商业竞争力的产品仍是需要解决的问题。

本发明的目的是，研究一种家蚕基因工程植酸酶制剂后加工处理工艺方法，使之能改善现有技术的不足，低成本、批量化生产畜禽饲料用基因工程植酸酶商品化制剂。

本发明的目的使通过如下的方法实现的。

家蚕基因工程植酸酶制剂后加工处理工艺方法，应用重组BmNPV载体-家蚕宿主表达系统生产植酸酶，用植酸酶基因替换家蚕核型多角体病毒基因组中的多角体蛋白基因，并使其处于多角体蛋白基因启动子的控制下，再将此重组质粒与野生型BmNPV-DNA共转染于家蚕细胞，通过体内同源重组得到带有外源植酸酶基因的重组病毒，再利用多角体蛋白基因的启动子启动植酸酶基因，并将此重组家蚕核型多角体感染家蚕，在蚕体内繁殖产生目标物植酸酶蛋白，其特征在于，收蚕后经匀浆后以细度大于16-60目的麸皮混匀，麸皮用量按重量比0.5-2.0/每克蚕混匀吸附，其混合物在温和温度下烘干，再经粉碎——过筛——搅拌均匀后制得畜禽用植酸酶制剂。

采用本发明的方法，在较小的生产成本下可保证较大批量的蛹(蚕)获得平均较高的酶活量，从而使基因工程植酸酶制剂能在在较大的工业化程度上实现商品化。

实施例1实验样本制取：

家蚕用P591品种家蚕，五龄起饷食第二天，扩增的重组BmNPV滴度标定达10⁶PFU，镜检无多角体，预试验表达量需≥200U/克，注射接种深度约皮下2mm，以注射后不出血或少量出血为好，注射量3～5μl，蚕幼虫用70％酒精棉球体表消毒。接种后，蚕体喷洒氯霉素(氯霉素先用适量无水乙醇溶解后，加无菌水定容至所需浓度，现配现用)，每隔两天喷一次。接种后，严格控制温度在25±1℃，湿度(常规)，通风良好。对蚕幼虫，需加强饲养管理，仔细观察蚕食量的变化及发病情况，对提早发病的先将其放于4℃冰箱保存，若发病过早，应注意观察是否为野生BmNPV感染所致，一旦确定，应立即对病源进行追查，对可疑物品及蚕室进行必要的消毒处理。观察中应随时注意淘汰细菌蚕。收发病蚕幼虫标准：一般收蚕时间为接种后4～5天，病蚕有狂躁乱爬、体躯肿胀，往往伴随有高节蚕的出现，血液变为乳白色浑浊等症状出现时收蚕匀浆。

工艺条件的选择

1.匀浆液用量

经多次实验，选取匀浆缓冲液的组成为：HAc-NaAc，pH 5.5，Ca²⁺1毫摩尔/升，缓冲液的加入量以缓冲液的加入量按0.5-2.0ml/克蚕为宜；

2.麸皮细度

将烘干后的麸皮分别粉碎至过8目、16目、30目、60目的筛网，与蚕浆混合吸附，再经50℃温和烘干粉碎过同样目数的筛网，取样测酶活，得如图1结果。图1为酶活性能与麸皮粉碎细度的关系图。

由图1看出：当粉碎细度在30目以上时，酶活性提高明显，而以60目时最高。然而，当粉碎细度超过30目以上时，粉碎时间将延长2～3倍，酶活提高与30目相比并不显著。因此，从产业化的角度看，30目附近的细度应该是最理想的。

3.烘干温度