[发明专利]用于转基因植物中生产类胡萝卜素的相关基因的合成

说明书

本发明涉及植物基因工程领域中的植物生物反应器，更具体地说是通过化学合成的方法合成能在植物体内生产类胡萝卜素的6个相关基因。

类胡萝卜素是重要的天然色素，广泛存在动物和植物体内，自目前为止有600多种类胡萝卜素被发现，其颜色从黄色至橙红色，长期用来修饰食品的颜色。随着对类胡萝卜素化学结构的了解，类胡萝卜素的功能逐渐被挖掘。

类胡萝卜素具有抗氧化功能。在类胡萝卜素化学结构中有9-11个共轭双键，能够与自由基结合。避免细胞的氧化损害累积到一定程度后造成细胞老化甚至死亡。类胡萝卜素具有抗癌变作用。在研究虾青素等类胡萝卜素对黄曲霉毒素引发肝癌的影响中发现，类胡萝卜素可以降低肝癌病灶的数目和大小。类胡萝卜素具有增强机体免疫作用。虾青素等类胡萝卜素能够刺激抗体的产生(刘子贻，1997，中国海洋药物)。

类胡萝卜素众多功能的发现，大大增加了市场上对该类化合物的需求。仅虾青素一种，每年的需求额即超过一亿美元(梁世中，2000，食品与发酵工业)。目前大部分类胡萝卜素化合物是通过化学合成获得，需要很高的成本和资源(Johnson EA，1995，Adv Biochem Eng Biotechnol)。通过大面积培养杜氏耐盐藻生物也可获得大量的类胡萝卜素，但是这种藻类只能在干旱的地区养殖，对水质、环境及光的要求很高(郑晓东，2000，浙江大学学报)。虾青素等类胡萝卜素化合物还可以直接从甲科类动物中提取，但是含量很低，不适合大量生产(中国饲料行业信息网)。利用微生物生产虾青素等类胡萝卜素化合物成了近些年研究的重点，其中以红法夫酵母菌研究最多，该菌具有作为色素生物来源的一些必要特征：快速异氧代谢，培养时间短，能够在发酵罐中实现高密度发酵。虽然这类微生物具有很大的开发潜力，但目前普遍存在产量低的缺陷，还未能进行大规模的商业化生产(王菊芳，2000，生物工程进展)。

利用基因工程技术，将合成虾青素等类胡萝卜素的关键酶基因克隆并改造，利用合适的启动子进行调控，将这些基因同时转化到细菌、酵母以及植物中，实现虾青素等类胡萝卜素化合物的高效表达，将能满足迅速发展的市场对这些产品的巨大需求。其中以培育能大量生产β-胡萝卜素和虾青素的植物更具社会价值和市场价值。以水稻、甘蓝和油菜等作物作为材料生产的金色水稻、金色甘蓝和金色油菜，将成为人类健康的风景线。

从糖酵解产物乙酰辅酶A开始合成β-胡萝卜素需要一系列酶催化。大多数生物要经过乙酰辅酶A到法呢基焦磷酸(FPP)阶段，FPP在不同的酶作用下，合成麦角固醇或β-胡萝卜素。从FPP到β-胡萝卜素需要四种酶参与。法呢基焦磷酸(FPP)在垅牛儿基垅牛儿基焦磷酸合成酶(CrtE)催化下合成垅牛儿基垅牛儿基焦磷酸(GGPP)，GGPP在八氢番茄红素合成酶(CrtB)作用下产生八氢番茄红素，之后在八氢番茄红素去饱和酶(CrtI)作用下逐渐形成番茄红素，最后在番茄红素β环化酶(CrtY)催化下，番茄红素合成β-胡萝卜素。虾青素是β-胡萝卜素合成的终止点，由β-胡萝卜素转变为虾青素需要加上两个酮基和羟基，体外合成比较困难。但是在生物体内只需在两个酶的催化下即能由β-胡萝卜素合成虾青素。β-胡萝卜素羟化酶(CrtZ)和β-胡萝卜素酮酶(CrtW)能够在β-胡萝卜素的C3/C3’和C4/C4’位置上加上羟基和酮基，形成虾青素(Claudia SD，2000，EnviromentalBiotechnology)。

至目前为止，分别从细菌、植物、藻类和真菌中克隆了近150个与类胡萝卜素合成有关的基因(Hirschberg J，1997，Purelity Applied Chemical)。这些功能相近的基因在核苷酸水平上差异很大。一方面，这些基因能够根据功能组合在一起，转化到不同的微生物或植物中，生产出各种各样的类胡萝卜素产品(Misawa N，1998，Applied and Environmental Microbiology)。另一方面，基因的差异给植物生产类胡萝卜素产品提供了保证，外源基因的转化不能改变植物中同功能基因的功能，造成基因沉默现象，相反能够加强类似基因的功能，提高产品的产量(Hirschberg J，2000，Nature Biotechnology)。