[发明专利]可表达外源性基因的人神经干细胞及其制备方法

说明书

本发明涉及一种人神经干细胞和基因治疗相结合的方法，具体涉及人神经干细胞的分离和克隆及外源性基因转移入神经干细胞的方法。

神经干细胞是具有自身更新和多潜能分化能力的一类神经细胞，它对治疗脑、脊髓损伤，脑中风和神经变性性疾病如帕金森氏病等具有潜在的治疗价值。神经干细胞分布于胚胎发育中的神经系统，并定点存在于成年哺乳类动物的脑神经组织中。神经干细胞亦可从胚胎干细胞(ES Cells)或非神经组织诱导培养。神经干细胞研究不仅可为临床多种神经系统疾病的治疗提供新的途径，而且还可推动人们对细胞跨系分化(trans-differetiation)的发育调控和脑学习记忆功能的细胞分子基础等生物学研究进行新的探索。目前神经干细胞或神经祖细胞的分离方法有下列几种：1、从畸胎瘤和神经肿瘤的细胞中分离，如NTERA-2细胞系；2、用永生化基因转化神经细胞，常用V-myc基因；3、用b-FGF、EGF和LIF(白血病抑制因子)等生长因子作为刺激分裂因子维持神经干细胞生存；4、用β-微管蛋白启动子和神经巢蛋白启动子基因操作标记分离人神经干细胞。上述方法中存在致癌的危险因素或分离克隆成功率低。

本发明的目的是提供一种可表达外源性基因的人神经干细胞及其制备方法。

本发明采用Hoechst33342四步骤法分离和克隆人胚神经干细胞FZ-B9和FZ-B7。为了使神经干细胞能表达外源性基因，采用重组腺病毒相关病毒载体(rAAV)为载体将标记性基因LacZ基因(市售)和治疗性基因胶质细胞起源的神经营养因子(GDNF)基因(U.S.A GeneBank)转移入神经干细胞。从而将干细胞治疗和基因治疗相结合。

本发明制备方法包括下述步骤：

一、神经干细胞的产生和培养

本发明遵守医学伦理原则。使用中国人胎龄为7周和9周的流产胚胎组织在无菌条件下收集并保存在4℃磷酸氢钠缓冲液(PBS Ph7.4)中。分离出前脑组织，并制备成细胞悬液和细胞团块的半混合状态加入到用多聚赖胺酸(PLL)预制表面的培养板(Costar)中，使用DMEM/F12/N2培养液(GibcoBRL)，其中含有人胰岛素25ng/ml，人转铁蛋白100μg/ml，人前列腺素20nM，谷胺酰氨2nM，葡萄糖6％，丁二胺60μM，氯化硒30nM，碳酸氢钠3mM，HEPES 5mM，肝素2μg/ml。9周胚胎细胞原代培养液加有10％胎牛血清(FCS)，原代细胞培养12小时后贴壁，部分细胞形成神经球体样。第三天后原代培养换为无血清培养液。7周胚胎细胞开始即为无血清培养，呈半悬浮状态生长。在含有bFGF和EGF的无血清条件下培养10-14天后，部分细胞死亡，部分球体样细胞生长旺盛，用吸管吹打分散后可传代培养。

二、神经干细胞的分离和克隆：

(1)将培养板中形成球体样形态的细胞在倒置显微镜下用微量吸管分离出来至上述培养液中，其中多富含干细胞成份；

(2)从原代细胞开始在培养液中加入人碱性纤维母细胞生长因子(bFGF)20ng/ml(R&D Systems,USA)和人表皮生长因子(EGF)20ng/ml(R&D)，促进细胞分裂增殖；

(3)使用Hoechst33342进行荧光流式细胞分离(FACS)。因Hoechst33342荧光物质可结合到富含C-G碱基的细胞DNA上，干细胞具有将这种Hoechst33342泵出细胞的能力，从而可分离出SP细胞(Side population，边际细胞)。在细胞培养液中加入5ng/ml荧光染料Hoechst33342(Sigma)和2％FCS以及HEPES 1mM，37℃温育1.5小时后保存在冰中。然后使用FACS流式细胞分离仪(Bector Dickinson,San Jose.CA)。Hoechst33342的激发光波长为350nm，使用450Bp20和675EFLP两个波长的滤光器分离微量而均匀的SP细胞。分离后的SP细胞放入12孔培养板中，加入含有bFGF和EGF的培养液继续培养。

(4)单细胞克隆化采用有限稀释法在96孔板上进行。细胞克隆增殖后移至24孔板内继续扩增。SP细胞克隆化成功率为1/32，而未进行FACS的细胞克隆化率为1/384)。单克隆化有助于鉴别干细胞分化潜力是自于单一克隆细胞还是由于多克隆混合培养的结果。