[发明专利]一种荧光标记效率检测的方法

权利要求书

1．一种荧光标记效率检测方法，其特征在于，通过检测探针的荧光信号值(F)，确定含有荧光基团的单核苷酸量(s)，并以此计算出该种核苷酸的总量(n)，最终可获得探针DNA的量(w)。以总的探针DNA的质量(w)、或以总的探针DNA的质量(w)除以模板mRNA或DNA的质量(r)的比值e来表示荧光标记效率，可表示为：w=4×324.5×n=1298×(mk+1)×s及通过测得F值或s值就可知荧光标记效率；

              e=(w/r)×100％=(1298×(mk+1)×s/r)×100％。

2．如权利要求1所述的荧光标记效率检测方法，其特征在于，该方法可以用于PCR法扩增中荧光标记效率的检测，荧光标记效率以最终可获得探针DNA的量(w)表示，w=4×324.5×n=1298×(mk+1)×s。

3．如权利要求1所述的荧光标记效率检测方法，其特征在于，该方法可以用于逆转录法中荧光标记效率的检测，荧光标记效率以最终可获得探针DNA的量(w)除以模板mRNA(r)的比值e表示，e=(w/r)×100％=(1298×(mk+1)×s/r)×100％。

4．如权利要求1所述的荧光标记效率检测方法，其特征在于，该方法可以用于循环逆转录法中荧光标记效率的检测，荧光标记效率以最终可获得探针DNA的量(w)除以模板mRNA(r)的比值e表示，e=((1298×(1×m+1)×s/n)/r)×100％,n为逆转录循环次数。

5．如权利要求1所述的荧光标记效率检测方法，其特征在于，在使用逆转录酶SuperscriptⅡ的逆转录过程中，以荧光物质Cy3或Cy5标记时，k值都为1，即含有荧光基团Cy3或Cy5的单核苷酸与不含荧光基团的单核苷酸掺入探针DNA链的机会基本均等；而在使用Taq酶的PCR反应中，使用Cy3或Cy5标记时，k值为10。

6、如权利要求1所述的荧光标记效率检测方法，其特征在于，可以用标准曲线法推算s值，并以此计算w或e值，其步骤包括：

将一系列不同浓度的荧光基团修饰的某种单核苷酸点于玻片上，用基因芯片荧光扫描仪扫描，计算单位体积的荧光信号总量F(F₁-F_n)，绘制F--荧光单核苷酸摩尔浓度(以c表示，c₁-c_n)标准曲线(在仪器的线性工作范围内，F与c成正比)，并计算标准曲线的斜率K。取适量经纯化后的荧光探针点于玻片上，用同样的扫描强度扫描，对照标准曲线以荧光信号总量F找到荧光单核苷酸的浓度c，或根据斜率计算c=K×F。

经纯化后的荧光探针样品的体积以v表示，则掺入探针的荧光单核苷酸总量s(摩尔量)，s=c×v。已知s值后，根据公式1(w=4×324.5×n=1298×(mk+1)×s)和公式2(e=(w/r)×100％=(1298×(mk+1)×s/r)×100％),即可计算w或e值。

7．如权利要求1所述的荧光标记效率检测方法，其特征在于，可以用渗入法推算s值，并以此计算w或e值，其步骤包括：

取一定体积未纯化的探针及同样体积的纯化后探针分别点于干净的玻片上，扫描，并从下面的公式算出掺入率(I):

    I=[(Fa×Da)/(Fb×Db)]×100％

其中：

    I-掺入率

    Fb-纯化前荧光值

    Fa-纯化后荧光值

    Db-纯化前稀释倍数

Da-纯化后稀释倍数已知纯化前反应液中荧光单核苷酸的总量S₀(单位为摩尔量)，则掺入探针cDNA中的荧光单核苷酸的量s=S₀×I。根据公式1(w=4×324.5×n=1298×(mk+1)×s)和公式2(e=(w/r)×100％=(1298×(mk+1)×s/r)×100％)，即可计算w或e值。