本发明提供了一种高效鉴定粒重基因GW5不同等位的引物组合及鉴定方法和应用,所述引物组合包括第一引物组和第二引物组,所述第一引物组包括序列号为SEQ ID NO.1的GW5_YN_F、序列号为SEQ IDNO.2的GW5_YN_R1、序列号为SEQ ID NO.3的GW5_YN_R2;所述第二引物组包括序列号为SEQ ID NO.4的GW5_YZ_F、序列号为SEQ ID NO.5的GW5_YZ_R1、序列号为SEQ ID NO.6的GW5_YZ_R2。本发明构建的引物组合鉴定类型能够实现同时鉴定粒重基因GW5的三种等位,是一种全新的标记组合类型,相比之前的鉴定标记,该标记组合的鉴定效率成倍增加,在节约成本、提高效率方面有巨大优势。