本发明提供了一种NK滋养层细胞及其制备方法和应用,所述NK滋养层细胞表达膜蛋白CD19、CD86、IL21、CD64和CD137L;所述IL‑21通过与CD8α跨膜区形成IL‑21‑CD8α融合蛋白表达在所述NK滋养层细胞表面;所述CD86包括SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列;所述IL‑21‑CD8α包括SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。本发明构建的NK滋养层细胞对CD19、CD86、IL21、CD64和CD137L的表达率高,各因子协同激活NK细胞的增殖能力,实现了体外诱导NK细胞分化成熟的效果。