本发明涉及害虫遗传防控领域,具体地,涉及一种靶向草地贪夜蛾Doublesex基因雌性特异E3外显子的sgRNA及其应用。本发明的靶向草地贪夜蛾Doublesex基因E3外显子的sgRNA在草地贪夜蛾Doublesex基因雌性特异E3外显子上的两个靶点的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。本发明利用CRISPR/Cas9系统遗传防控草地贪夜蛾的方法,包括以下步骤:1)获得草地贪夜蛾雌性特异E3外显子序列;2)设计草地贪夜蛾Doublesex基因的E3外显子的sgRNA;3)将Cas9的mRNA或蛋白和步骤2)设计的sgRNA混合,将混合物导入草地贪夜蛾的受精卵,获得雌性特异性不育的草地贪夜蛾。本发明利用CRISPR/Cas9技术实现草地贪夜蛾dsx雌性特异性外显子高效准确的敲除,确定dsx基因作为靶标在草地贪夜蛾遗传防控的重要应用价值。