本发明属于细菌质粒技术领域,公开了一种耐阿米卡星的重组质粒pET28a(+)‑rmtB及其应用,耐阿米卡星的重组质粒pET28a(+)‑rmtB包括载体片段pET28a(+)和基因片段rmtB,耐阿米卡星的重组质粒pET28a(+)‑rmtB的核苷酸序列为SEQ ID NO:1;载体片段pET28a(+)来自质粒pET28a(+),基因片段rmtB来自一株阿米卡星耐药的大肠杆菌菌株;载体片段pET28a(+)的核苷酸序列为本发明利用重组质粒pET28a(+)‑rmtB,为阿米卡星敏感的受体菌提供一种质粒选择。本发明的质粒可以耐阿米卡星,利于对卡那霉素和氨苄西林耐药、阿米卡星敏感的受体菌株的分子克隆筛选。