本发明提供了一种同时检测呼吸道合胞病毒、腺病毒和人博卡病毒试剂盒和同时检测呼吸道合胞病毒、腺病毒和人博卡病毒的方法。该同时检测呼吸道合胞病毒、腺病毒和人博卡病毒试剂盒包括有分别特异性扩增呼吸道合胞病毒基因、腺病毒基因、人博卡病毒基因的如SEQ ID NO:1、2、4、5、7、8引物基因序列,用于检测呼吸道合胞病毒基因、腺病毒基因、人博卡病毒基因的如SEQ ID NO:1、6、9的分子信标探针。本发明同时检测呼吸道合胞病毒、腺病毒和人博卡病毒试剂盒采用能同时检测呼吸道合胞病毒、腺病毒和人博卡病毒,且检测周期短,效率高。另外,还能保证两两荧光信号之间无相互干扰,其灵敏度高。