本发明提供了一种鉴别扁颌针鱼未定种sp与横带扁颌针鱼的DNA条形码及其鉴别方法和应用,属于分子生物学技术领域,本发明所述扁颌针鱼未定种sp的DNA条形码序列如SEQ ID No.1所示;所述横带扁颌针鱼的DNA条形码序列如SEQ ID No.2所示。扩增所述的DNA条形码的引物,包括12S‑F294和12S‑R510;所述方法包括以下步骤:提取待鉴别样本的基因组DNA;用所述的引物扩增所述的待鉴别DNA;将扩增产物的序列与DNA条形码进行比对;确定待鉴别样本的种类利用本发明提供的DNA条形码鉴别扁颌针鱼未定种sp与横带扁颌针鱼结果稳定,可重复性强。