本发明涉及生物技术领域,具体涉及敲低TLR4基因猪肺泡巨噬细胞系的构建方法及其应用。该猪肺泡巨噬细胞系的保藏编号为:CCTCC NO:C2019174。敲低TLR4基因猪肺泡巨噬细胞系的构建方法:将含有sgRNA的重组慢病毒转染猪肺泡巨噬细胞,经抗性筛选得到所述TLR4基因敲低的猪肺泡巨噬细胞系;所述sgRNA由SEQ ID NO.1~2所示核苷酸序列退火得到本发明构建的敲低TLR4基因猪肺泡巨噬细胞系可以促进口蹄疫病毒复制,与未敲低的细胞系相比,该敲低TLR4基因猪肺泡巨噬细胞系中口蹄疫病毒复制量是前者的2~3倍。