本申请实施例属于丙酮酸氧化酶制备领域，涉及一种在大肠杆菌中制备丙酮酸氧化酶的方法，包括获取绿色气球菌丙酮酸氧化酶的蛋白序列SEQ ID NO:2，通过大肠杆菌同义密码子优化所述绿色气球菌丙酮酸氧化酶的蛋白序列，构建绿色气球菌丙酮酸氧化酶重组质粒；将所述绿色气球菌丙酮酸氧化酶重组质粒转化至大肠杆菌；挑取所述大肠杆菌中单克隆进行扩大培养和诱导表达，获得表达绿色气球菌丙酮酸氧化酶的菌液；对所述绿色气球菌丙酮酸氧化酶的菌液进行纯化操作，获得绿色气球菌丙酮酸氧化酶。本申请表达的丙酮酸氧化酶有产量高、生产周期短、活性高，能够工业化生产等优点。
