[发明专利]转导cas9基因到哺乳动物细胞进行基因编辑的方法在审
| 申请号： | 201911105148.0 | 申请日： | 2019-11-13 |
| 公开（公告）号： | CN110684801A | 公开（公告）日： | 2020-01-14 |
| 发明（设计）人： | 马峰;华权高;沈鹤霄;杨洁;陈莹;舒芹 | 申请（专利权）人： | 武汉华美生物工程有限公司 |
| 主分类号： | C12N15/866 | 分类号： | C12N15/866;C12N15/90 |
| 代理公司： | 11570 北京众达德权知识产权代理有限公司 | 代理人： | 刘杰 |
| 地址： | 430206 湖北省武汉市东*** | 国省代码： | 湖北;42 |
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| 摘要： | 本发明提供了一种利用昆虫杆状病毒转导cas9基因到哺乳动物细胞进行基因编辑的方法，该方法通过构建含有gRNA、cas9、筛选标记的基因片段、哺乳动物细胞可识别的启动子、转录终止子序列的重组Bacmind质粒，并将其转染sf9细胞，包装获得重组杆状病毒，用其对哺乳动物细胞进行cas9的转导。利用杆状病毒可将大DNA导入哺乳动物细胞，降低cas9/筛选标记基因导入哺乳动物细胞的难度，本发明方法对于cas9的转导效率优异；本发明接近单细胞转导方法，无需反复大量稀释筛选即可找到成功编辑的克隆；所用携带有gRNA/cas9基因的杆状病毒，滴度高，易于保存、复制，可高效重复利用，便于开展相关工作。 | ||
| 搜索关键词： | 哺乳动物细胞 转导 杆状病毒 基因 昆虫杆状病毒 筛选标记基因 重组杆状病毒 转录终止子 基因片段 筛选标记 重复利用 转导效率 可识别 启动子 大DNA 滴度 构建 稀释 质粒 转染 克隆 复制 筛选 携带 保存 成功 | ||
【主权项】：
1.一种利用昆虫杆状病毒转导cas9基因到哺乳动物细胞进行基因编辑的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：/n(1)向Bacmid质粒中插入gRNA、cas9、筛选标记的基因片段、哺乳动物细胞可识别的启动子、转录终止子序列，构建得到重组Bacmid质粒；/n(2)将所得重组Bacmid质粒转染sf9细胞，包装获得重组杆状病毒，收集含有病毒粒子的sf9细胞上清；/n(3)将哺乳动物细胞以每孔不超过10个置于细胞培养板中，然后加入上述重组杆状病毒毒液，进行培养；/n(4)将发生了转导的细胞进行稀释，挑取单克隆，确认基因编辑效果，获得编辑成功的单克隆细胞株。/n
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