[发明专利]猪病毒性腹泻病病原的五重RT-PCR检测方法

摘要

本申请公开了猪病毒性腹泻病病原的五重RT‑PCR检测方法，其中5对引物分别为猪德尔塔冠状病毒（又名猪丁型冠状病毒）的检测引物、猪凸隆病毒的检测引物、猪流行性腹泻病毒的检测引物、猪急性腹泻综合征冠状病毒的检测引物、传染性胃肠炎病毒的检测引物。以待检样品的核酸或反转录产物作为模板，采用2×Taq Plus Master Mix，使用本申请中的5对引物对进行PCR扩增。该专利允许在一个PCR反应管中最多同时检测出5种能够导致猪群腹泻的病毒，其检测灵敏度达到初始模板浓度为每微升1×103个拷贝（1×103 copies/μL），并具有极佳的特异性和重复性，可以直接应用到临床样品检测中。

主权项

1.猪病毒性腹泻病病原的五重RT-PCR检测方法，其特征在于，包括如下步骤：/n第一步，设计5种病毒的特异性RT - PCR检测引物对序列：/n用于检测猪德尔塔冠状病毒（Porcine Deltacoronavirus, PDCoV）的引物对序列：上游引物PD - Detection (F)的引物序列为5’- TACAACCTAAGGCTAACCAAC - 3’，/n下游引物PD - Detection(R)的引物序列为5’- ACAACTTTACCTGCCTTACATA - 3’；/n用于检测猪凸隆病毒（Porcine Torovirus, PToV）的引物对序列：/n上游引物PT - Detection (F)的引物序列为5’- TCCTCGTGACACTTTATCTCA - 3’，/n下游引物PT - Detection (R)的引物序列为5’- TTCACTAACATCCTCTACCACA - 3’；/n用于检测猪流行性腹泻病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus, PEDV）的引物对序列：/n上游引物PE - Detection(F)的引物序列为5’- TGAAGACTTTTGACAATCCAC - 3’，/n下游引物PE - Detection (R)的引物序列为5 - ACACAGCATTACCATCTAC - 3’；/n用于检测猪急性腹泻综合征冠状病毒（Swine Acute Diarrhea SyndromeCoronavirus, Sads-CoV）的引物对序列：/n上游引物SD - Detection (F)的引物序列为5’- GCTCAGTACATCTTTTCAACT - 3’，/n下游引物SD - Detection (R)的引物序列为5’- CATAGTCATACTCGCTACCTT - 3’；/n用于检测传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus, TGEV）的引物对序列：/n上游引物TG - Detection (F)的引物序列为5’- TACATACCACCTGCTTATGCAA - 3’，下游引物TG - Detection (R)的引物序列为5’- TACACAATTGACCAATCAACAC - 3’；/n第二步，获取待检样品的cDNA：提取腹泻粪便样品或肠道组织的总RNA，反转录为cDNA模板；/n第三步，使用5对RT - PCR引物进行检测：将所述 PDCoV、PToV、PEDV、Sads-CoV和TGEV的引物对置于PCR反应体系中，以第二步中cDNA作为模板，进行PCR扩增；/n第四步：用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，依据电泳条带出现的位置即可确定该样品中是否存在PDCoV（148 bp）、PToV（274 bp）、PEDV（411 bp）、Sads-CoV（574 bp）与TGEV（833bp）。/n