[发明专利]一种寻找胚胎干细胞向原始生殖细胞分化过程中Wnt信号通路的靶基因的方法在审
| 申请号： | 201910593462.1 | 申请日： | 2019-07-03 |
| 公开（公告）号： | CN110272919A | 公开（公告）日： | 2019-09-24 |
| 发明（设计）人： | 李碧春;张晨;左其生;王曼;金晶;李婷婷;张亚妮;孙红艳 | 申请（专利权）人： | 扬州大学 |
| 主分类号： | C12N15/867 | 分类号： | C12N15/867;C12N15/66;C12N5/10;C12Q1/686 |
| 代理公司： | 北京高沃律师事务所 11569 | 代理人： | 马云华 |
| 地址： | 225009 *** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | 本发明提供一种寻找胚胎干细胞向原始生殖细胞分化过程中Wnt信号通路的靶基因的方法，涉及生物技术领域，本发明所述方法首先对Wnt信号通路的关键转录因子TCF7L2进行靶基因预测，对预测靶基因进行GO功能注释，筛选出其中共同参与生殖细胞发育及干细胞分化的保守性靶基因作为待选靶基因；通过体内外试验验证Wnt信号对待选靶基因转录水平的调控作用，检测待选靶基因的启动子中所述转录因子结合位点缺失时、Wnt信号对待选靶基因转录水平是否有调节作用，通过ChIP‑qPCR验证β‑Catenin/转录因子复合物与待选靶基因的结合作用，从而确定待选靶基因是否对Wnt信号具有靶向响应作用。本发明所述方法简单易行。 | ||
| 搜索关键词： | 靶基因 原始生殖细胞 胚胎干细胞 分化过程 转录水平 生殖细胞 转录因子结合位点 转录因子复合物 验证 生物技术领域 靶基因预测 干细胞分化 调控作用 功能注释 转录因子 保守性 启动子 靶向 筛选 体内 发育 检测 试验 响应 预测 | ||
【主权项】：
1.一种寻找胚胎干细胞向原始生殖细胞分化过程中Wnt信号通路的靶基因的方法，包括以下步骤：(1)采用预测软件对Wnt信号通路的某一转录因子的结合靶基因预测，对预测的靶基因进行GO功能注释，根据注释选取生殖细胞发育和干细胞发育过程中共同的靶基因，得到待选靶基因；(2)对待选靶基因进行体内和体外实验验证Wnt信号通路对待选靶基因转录水平是否有调节作用；(3)检测待选靶基因的启动子中所述转录因子结合位点缺失时、Wnt信号对待选靶基因转录水平是否有调节作用；(4)通过ChIP‑qPCR验证β‑Catenin/转录因子复合物与待选靶基因的结合作用；(5)若待选靶基因经过步骤(2)～(4)的检测的结果为：Wnt信号通路对待选靶基因转录水平有调节作用、待选靶基因的启动子中所述转录因子结合位点缺失时的Wnt信号通路对待选靶基因转录水平无调节作用并且β‑Catenin/转录因子复合物能够通过结合待选靶基因启动子区域调节其转录，则判断该待选靶基因为Wnt信号通路的直接靶基因；所述步骤(2)～(4)之间无时间顺序上的限定。
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- 本发明提供一种CXCR4RNAi慢病毒载体的构建方法，通过根据GenBank CXCR4的mRNA全序列，经BLAST同源性比对证实特异性后应用RNA structure 4.4软件对靶mRNA序列的二级结构进行评估，得到19nt靶序列；然后针对各靶序列设计合成其相应的两条shRNA寡核苷酸单链；然后环状空质粒酶切后，酶切片段连接PLVX.1载体与shRNA寡核苷酸双链，连接形成的重组载体，连接产物转化新鲜感受态细胞E.coli DH5α，37℃培养16h后挑阳性克隆进行菌落PCR鉴定，测序结果验证重组质粒构建成功后，提取重组质粒。
- 利用磁小体编码基因对外源细胞进行活体示踪的方法-201910196842.1
- 朱剑虹;魏乃礼;王帆;朱侗明 - 复旦大学附属华山医院;朱剑虹
- 2019-03-15 - 2019-07-26 - C12N15/867
- 利用磁小体编码基因对外源细胞进行活体示踪的方法，将编码磁小体的关键基因mms6导入至外源细胞基因组内，诱导外源细胞表达mms6蛋白，此蛋白可以结合内源性铁离子，在体内合成内源性铁磁性纳米颗粒；将外源细胞移植入体内后，定期进行核磁共振扫描，通过核磁共振T2豫驰像检测出内源性的铁磁性纳米颗粒信号，可即时定位移植的外源细胞的位置。本发明中磁小体编码基因mms6所产生的示踪信号可传代给子代细胞，让外源细胞示踪信号持续存在，实现外源细胞的长期活体示踪。
- 一种稳定表达mCherry-tau的细胞系及其构建方法与应用-201910206151.5
- 陈杰瑞;刘琼;肖时峰;李楠 - 深圳大学
- 2019-03-19 - 2019-07-26 - C12N15/867
- 本发明公开一种稳定表达mCherry‑tau的细胞系及其构建方法与应用，所述方法包括步骤：预先制备重组质粒pLVX‑mCherry‑tau；将所述重组质粒pLVX‑mCherry‑tau与psPAX2以及pMD2.G混合并转染至HEK293T细胞中，获得含有mCherry‑tau基因的慢病毒颗粒；将所述慢病毒颗粒感染HEK293细胞，采用含有嘌呤霉素的培养基对慢病毒颗粒感染的HEK293细胞进行抗性筛选，获得稳定表达mCherry‑tau的细胞系。本发明构建的细胞系可用于筛选阻断tau表达和聚集的化合物，为开发抑制tau蛋白的表达、聚集、扩散和蔓延，从而治疗AD的药物，提供了一个筛选工具和平台。
- 一种包含超级增强型TIL细胞的免疫细胞药物-201810037682.1
- 谷为岳 - 北京卡替医疗技术有限公司
- 2018-01-16 - 2019-07-23 - C12N15/867
- 本发明提供了一种将靶向B细胞的嵌合抗原受体(BCAR)和免疫检查点‑共刺激信号因子转换分子(Switch)联合跨膜表达在肿瘤浸润T淋巴细胞(TIL)或外周血游离肿瘤浸润T淋巴细胞(pTIL)上，制备“超级增强型TIL(SuperTIL)”细胞，以及制备包含SuperTIL的免疫细胞治疗药物。本发明所述药物可借助TIL本有的肿瘤特异识别性，实现SuperTIL对肿瘤的特异识别和杀伤，并借助SuperTIL的BCAR结构与体内B细胞的相互作用实现对SuperTIL在体内的大量扩增而增进对肿瘤的杀伤效果，以及借助SuperTIL的单种或多种Switch结构突破肿瘤微环境障碍，进一步增强SuperTIL对肿瘤的杀伤能力。本发明可成为一种免疫细胞药物应用于不区分癌种的抗肿瘤治疗中。
- 专利分类
