[发明专利]一种大豆原生质体的制备和转化方法

摘要

本发明公开了一种大豆原生质体的制备和转化方法，涉及植物基因工程技术领域，所述方法包括以下步骤：1)诱导获得大豆胚性愈伤；2)加入酶溶液酶解所述胚性愈伤，过滤离心后加入W5‑23％溶液后离心得到纯化后的原生质体；3)将所述纯化后的原生质体放于冰上处理后用MMG悬浮液重悬，再依次加入质粒和PEG4000溶液，混匀静置后，加入W5溶液终止转化反应，离心得到的原生质体用WI溶液重悬后转移到培养皿中避光室温放置。本发明优化了酶溶液的配比及PEG瞬时转化反应条件，显著提高了大豆原生质体的产量和转化率，更有助于鉴定大豆基因功能，并进一步为其他植物、其他部位的原生质体的制备和转化条件探索提供了可靠的依据。

主权项

1.一种大豆原生质体的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：步骤一、挑选饱满大豆幼荚，消毒后，剥出幼胚，除去种皮，将所述幼胚近轴端接于D40培养基，在恒温条件25‑26℃，16h/8h，300μmol·m^‑2·s^‑1下培养25‑35天，诱导出直径2.5‑3.5mm体细胞胚后转入D20培养基中培养15‑25天，不断转入新鲜配置的D20培养基中继代培养，获得胚性愈伤；步骤二、将所述步骤一中得到的胚性愈伤，除去粘结的培养基部分，并分开成一个个的颗粒状后，加入酶溶液，进行酶解反应；步骤三、用200目的尼龙网细胞筛过滤所述酶解反应后的混合物，将得到的滤液以800r·min^‑1离心5min后，除去上清液，并加入10mL W5溶液冲洗2次，得到粗纯后的原生质体；步骤四、向所述步骤四中得到的所述粗纯后的原生质体中加入5mL W5‑23％溶液，以800r·min^‑1离心5min后，除去上清液，并用W5溶液重悬所得到的纯化后的原生质体。