[发明专利]一种利用枯草芽孢杆菌整合位点的酶的活性恢复筛选整合重组子的方法

摘要

本发明具体涉及一种利用枯草芽孢杆菌整合位点的酶的活性恢复筛选整合重组子的方法。步骤是：1)构建抗性基因整合质粒，转化枯草芽孢杆菌，筛选得到整合位点的酶的基因3′端缺失而失活的枯草芽孢杆菌；2)构建外源基因整合质粒；3)外源基因整合质粒转化步骤1)获得的枯草芽孢杆菌，以整合位点的酶可酶解利用的物质的琼脂固体培养基作为筛选培养基，通过抗生素抗性失活、整合位点的酶活性，筛选出外源基因整合质粒通过同源双交换整合到枯草芽孢杆菌的重组工程菌。本发明优点是：不需要抗生素抗性基因作为重组枯草芽孢杆菌的筛选标记；获得的重组枯草芽孢杆菌保持整合位点的酶活性。

主权项

1.一种利用枯草芽孢杆菌整合位点的酶的活性恢复筛选整合重组子的方法，其特征在于，具体步骤是：(1)构建抗性基因整合质粒，转化枯草芽孢杆菌，筛选得到整合位点的酶的基因3′端缺失而失活的枯草芽孢杆菌作为宿主菌，具体操作如下：S1、构建使整合位点的酶的基因3′端缺失而失活的抗性基因整合质粒，该整合质粒的同源双交换的DNA序列为A‑ARG‑C；其中，A表示上游同源臂，是枯草芽孢杆菌整合位点的酶基因5′端的一段DNA序列；C表示下游同源臂，是整合位点的酶基因终止密码子后的一段DNA序列；同源臂间为抗生素抗性基因ARG；S2、筛选整合位点的酶的基因3′端缺失而失活的枯草芽孢杆菌：线性化的抗性基因整合质粒转化枯草芽孢杆菌，在含抗生素的固体培养基上培养、筛选，通过抗生素抗性及整合位点的酶失活，得到整合位点的酶的基因3′端缺失而失活的枯草芽孢杆菌；(2)构建外源基因整合质粒，其中同源双交换的DNA序列为AB‑EGEU‑C；其中，AB是枯草芽孢杆菌整合位点的酶基因的完整序列；C表示下游同源臂，是整合位点的酶基因终止密码子后一段DNA序列；同源臂间为外源基因表达单元EGEU；(3)筛选外源基因整合到枯草芽孢杆菌整合位点的枯草芽孢杆菌：线性化的外源基因整合质粒转化整合位点的酶的基因3′端缺失而失活的枯草芽孢杆菌，以整合位点的酶可酶解利用的物质的琼脂固体培养基作为筛选培养基，通过抗生素抗性失活、整合位点的酶活性，筛选出外源基因整合质粒通过同源双交换整合到枯草芽孢杆菌的重组工程菌。