[发明专利]一种提高红曲色素产量的方法

摘要

本发明提供了一种提高红曲色素产量的方法。该技术方案首先从植物双元质粒pCambia0380载体出发，改造并构建了一种适合丝状真菌基因敲除的双元质粒载体pHph0380。在此基础上，从红色红曲霉CICC41233中克隆得到糖转运蛋白gltp1基因上下游同源臂片段，与质粒载体pHph0380连接后，通过根癌农杆菌EHA105介导将其转化至亲本红色红曲霉中，构建得到了重组菌株。红曲色素发酵结果表明，本方法所构建的重组菌株，其红曲色素积累时间显著提前，且醇溶性色素产量得到明显提高，在发酵144h时，醇溶性色素产量较亲本菌株提高74％。本发明利用基因工程手段使红曲霉发酵产红曲色素的时间提前，提高了淀粉的利用率，提高了红曲色素的产量。

主权项

1.一种提高红曲色素产量的方法，其特征在于包括以下步骤：1)取植物双元质粒pCambia0380，用限制性内切核酸酶Hind III与Bgl II酶切，而后将一对依次含有Hind III、Kpn I、Sac I、Pac I、Pme I、Xho I、Xba I、Bgl II酶切位点的寡核苷酸序列通过T4 DNA连接酶与之连接，即得到双元质粒表达载体pCambia0380G；2)以质粒pMD19‑PgpdA‑hph‑TtrpC为模板，采用一对引物扩增得到hph表达盒片段，用限制性内切核酸酶Sac I与Xho I同时酶切所述hph表达盒片段以及双元质粒表达载体pCambia0380G，而后通过T4 DNA连接酶将二者连接，即得到双元质粒敲除载体pHph0380；3)以红色红曲霉CICC41233总DNA为模板，采用一对引物扩增出糖转运蛋白gltp1基因的上游同源臂片段；以红色红曲霉CICC41233总DNA为模板，采用另一对引物扩增出糖转运蛋白gltp1基因的下游同源臂片段；将所述上游同源臂片段和所述下游同源臂片段分别连接至所述载体pHph0380上，即得到双元质粒敲除载体pHph0380‑GLTP；4)将所述双元质粒敲除载体pHph0380‑GLTP导入红色红曲霉菌株中，构建得到重组菌株；5)利用所述重组菌株发酵产红曲霉素。