[发明专利]一种含有多杀菌素多操纵子人工基因簇质粒的构建方法与应用

摘要

本发明涉及一种含有多杀菌素多操纵子人工基因簇质粒的构建方法与应用。本发明利用DNA组装技术和组成型启动子驱动的过表达策略，实现了大环内酯类生物杀虫剂多杀菌素的高效异源表达。本发明将多杀菌素合成途径中的23个基因按功能分为五组，分别置于不同组成型强启动子的控制下，构建了102.6kb的人工基因簇，经反转录PCR分析，多杀菌素生物合成的23个基因共分为7个操纵子，与原始基因簇相比，人工基因簇在异源宿主白色链霉菌J1074中的多杀菌素产量提高了328倍。本发明建立的多操纵子人工基因簇策略为次级代谢产物的合成生物学研究提供了新方法。

主权项

1.一种含有多杀菌素多操纵子人工基因簇质粒的构建方法，其特征在于，步骤如下：(1)以刺糖多孢菌DSM44228的基因组DNA为模板，XbaI、HpaI双酶切得71.3kb XbaI‑HpaI片段和19.4kb HpaI片段，将71.3kb XbaI‑HpaI片段克隆到pBeloBAC11载体构建得重组质粒载体pBAC‑spn71XH；将19.4kb HpaI片段克隆到pBR322‑amp载体构建得重组质粒载体pBR322‑spn19H；(2)将鼠李糖合成基因gtt，gdh‑kre，epi和卡那霉素抗性基因neo克隆到pBR322‑amp载体构建得重组质粒载体pBR322‑Rhaneo；将pBR322‑Rhaneo与步骤(1)中的pBR322‑spn19H重组得重组质粒载体pBR322‑spnERhaneo；(3)将步骤(1)中得到的pBAC‑spn71XH与步骤(2)得到的pBR322‑spnERhaneo重组得含有完整多杀菌素生物合成基因簇的BAC载体pBAC‑spn；将apra‑oriT‑attP‑phiC31int基因盒与pBAC‑spn经重组得大肠杆菌链霉菌穿梭质粒pBAC‑spn‑phiC31‑apra；(4)将多杀菌素生物合成基因spnJ，spnM，spnF，spnL，gtt，gdh，epi，kre，spnG，spnI，spnK，spnH，spnP，spnO，spnN，spnQ，spnR，spnS，白色链霉菌J1074的组成型强启动子SA15p，SA2p，SA6p，SA31p，SA13p，氯霉素抗性基因cm，与pBR322‑amp‑ccdB载体经多片段组装得重组质粒载体pBR322‑spnFSRhaNEW；(5)以氨苄青霉素抗性基因amp和潮霉素抗性基因hyg分别替换步骤(3)中pBAC‑spn‑phiC31‑para中的spnF‑spnS基因和鼠李糖合成基因得重组质粒载体pBAC‑spnAE‑hyg‑amp，将步骤(4)得到的pBR322‑spnFSRhaNEW插入到pBAC‑spnAE‑hyg‑amp中spnA的上游，得到含有多杀菌素多操纵子人工基因簇质粒pBAC‑spnNEW。