[发明专利]类风湿关节炎大鼠炎症因子检测引物及其方法

摘要

本发明涉及生物医疗技术领域，公开了类风湿关节炎大鼠炎症因子检测引物及其方法，准备好试验动物及其组织后，提取CIA大鼠关节总RNA，检测总RNA纯度、浓度，对总RNA反转录，合成5对特异性引物，以CIA大鼠cDNA为模板，使用15μL体系PCR检测，在凝胶成像系统中，隔离板将紫外线隔开，切下含有大鼠RelA、TLR4、AKT1、IL6、NF‑κB cDNA片段的凝胶，快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行回收，将回收出来的DNA片段连接至T‑Vector，转化后蓝白斑筛选及测序。本发明建立CIA大鼠模型，利用分子生物学手段检测类风湿关节炎大鼠关节中核因子κB亚基p65、Toll样受体4、AKT丝氨酸/苏氨酸激酶1、白介素6、核因子κB亚基等关键炎症因子的表达，对于实现早期预防和治疗RA具有重要的意义。

主权项

1.类风湿关节炎大鼠炎症因子检测引物及其方法，其特征在于，包括如下步骤：S1：准备试验动物及其组织选取24只42±2日龄健康状况良好、体重相近(170±10g)Wistar雌性大鼠，根据每组间平均体重相近原则，随机分为2个试验组：I组，空白对照组(n＝12)：饲喂基础日粮+水；II组，CIA模型组(n＝12)：多点皮下注射牛II型胶原；S2：总RNA的提取依据RNAiso Plus实验操作说明提取CIA大鼠关节总RNA；S3：总RNA浓度的测定NanoDrop ND‑2000检测总RNA纯度、浓度S4：cDNA合成按照SYBR PrimeScriptTM RT Reagent Kit试剂盒操作说明进行，对总RNA反转录；S5：引物设计与合成参照已登录大鼠RelA、TLR4、AKT1、IL6、NF‑κB cDNA序列，利用Primer Premier 5.0软件结合NCBI Blast在线引物设计，合成5对特异性引物；S6：凝胶电泳检测以CIA大鼠cDNA为模板，使用15μL体系PCR检测；S7：回收和纯化PCR产物在凝胶成像系统中，隔离板将紫外线隔开，切下含有大鼠RelA、TLR4、AKT1、IL6、NF‑κB cDNA片段的凝胶，快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行回收；S8：目的片段与载体连接按照pMD18‑T试剂盒使用说明将回收出来的DNA片段连接至T‑Vector；S9：转化S10：蓝白斑筛选及测序第2d转化的平板中，一部分长有蓝斑，一部分长有白斑，挑取白色单菌落，放入含AMP的LB液体培养基中，37℃ 150r/min恒温摇荡，当白色云雾时将其取出，4℃保存，菌液交由公司进行序列测定。