[发明专利]一种丹参酮IIA诱导癌细胞HepG2凋亡的实验方法

摘要

本发明公开了一种丹参酮IIA诱导癌细胞HepG2凋亡的实验方法，具体的实验过程如下：（1）实验材料准备；（2）细胞培养与处理；（3）RT‑PCR测定；（4）Western Blot测定；（5）Annexin V‑FITC染色；（6）生物信息数据库筛选与分析；（7）转录因子筛选测定；（8）Hoechst 33324染色；（9）体外动力学结合分析；（10）统计分析。本发明的有益条件在于：通过miR30b‑p53‑PTPN11/SHP2信号通路诱导来实现人肝癌细胞HepG2凋亡。

主权项

1.一种丹参酮IIA诱导癌细胞HepG2凋亡的实验方法，其特征在于，具体的实验过程如下：（1）实验材料准备：丹参酮IIA（> 98.0％）；p53，Bcl2和SHP2抗体；通过primer 5.0设计了Tp53，PTPN11，miR30a，b，c和d，Bax，Bcl2和p21的mRNA序列；Annexin V‑FITC染色试剂盒和3‑（4，5‑二甲基‑2‑噻唑基）‑2，5‑二苯基四唑溴化物（MTT）溶液；细胞培养基DMEM和胎牛血清（FBS）；（2）细胞培养与处理：人肝癌细胞为HepG2和Hep3B，将细胞用含有10％胎牛血清、青霉素100U/mL、链霉素100μg/mL的DMEM培养液于37℃，5％CO2条件下培养，当汇合时，用一系列剂量的丹参酮IIA处理细胞，24小时后，收集培养基和细胞，并制备用于以下生物测定；（3）RT‑PCR测定：根据试剂盒说明从细胞中提取总RNA，通过Nano Drop测定RNA的质量，相应基因的扩增通过Applied Biosystems进行，通过2‑△△CT计算数据，并与空白样品相比分析每个基因的诱导倍数；（4）Western Blot测定：用具有1mM苯甲基磺酰氟（PMSF）的RIPA裂解物分离总细胞蛋白，蛋白质浓度按照BCA试剂盒说明书的指导进行测定，在SDS‑10％聚丙烯酰胺凝胶上分离约50μg蛋白质，然后转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，在5％脱脂奶粉中封闭后，将膜与抗体在4℃下孵育过夜，第二天，将膜与第二抗体杂交，通过使用化学发光试剂观察蛋白质，并在ChemiScope上观察，并使用软件ChemiAnalysis来计算蛋白质条带的密度；（5）Annexin V‑FITC染色：收集细胞并用5μL Annexin V‑FITC和10μL PI染色，在黑暗中孵育至少5分钟后，通过流式细胞术分析凋亡细胞；（6）生物信息数据库筛选与分析：我们对59篇文献中所涉及到的部分基因进行了一下整理，过滤掉人意外物种的基因，修正基因symbol，过滤重复基因，最终得到61个基因，GeneCodis是一个整合了各种分析工具和数据的生物信息数据库，为大规模的基因或蛋白列表提供系统综合的生物功能注释信息，在此，我们使用GeneCodis对这61个基因集执行Go富集分析和信号通路功能注释，GeneMania数据库通过嵌入软件cytoscape能对61列表基因进行相关关系网络图谱绘制，61个选择的基因的网络由GeneMania自动产生并通过Cytoscape显现，Gene2Networks整合了十个哺乳动物相互作用网络数据集，相关图像的重建由Gene2Networks与Cytoscape进行，为了进一步确定丹参酮IIA影响的途径，我们在Cytoscape中绘制了相互作用网络图以便找出感兴趣的信号分子；（7）转录因子筛选测定：LASAGNA‑Search 2.0提供1792个转录因子模型和15个启动子检索物种是TF结合位点研究的网络工具，可在http://biogrid‑head.engr.uconn.edu/lasagna_search/ [LASAGNA‑Search2.0： 综合转录因子结合位点搜索和在浏览器中的可视化]，在本研究中，我们使用LASAGNA‑Search 2.0筛选靶向基因的TF，在输入基因符号并选择物种作为人后，我们获得了TF的名称，我们的基因组的结合序列，结合位置，链，结合分数，p值和E值，在P<0.01时具有最大结合评分的序列被认为是靶向基因的结合位点；（8）Hoechst 33324染色：细胞中染色质的凝集是指示细胞毒性的一个毒理学终点，用一定剂量的丹参酮IIA作用24小时后，使用Hoechst‑33324染色HepG2细胞，室温下染20min，并用PBS洗涤两次，在Leica荧光显微镜下观察细胞的形态；（9）体外动力学结合分析：p53和PTPN11之间的结合亲和力的潜力在生物分子相互作用分析多层阵列HT上进行，将二十八个PTPN11序列，雷帕霉素（设定为阳性对照）和DMSO（阴性对照）印在3D光交联的小分子微阵列上，每个样品重复三次，将微阵列真空干燥，并在光交联剂中进行交联反应，用去离子水洗涤物理吸收，然后在使用前用N 2流干燥，在25℃下在加样缓冲液（PBS, pH = 7.4）中加载约650μL的系列浓度的p53（75, 150, 300, 600nM），结合和解离的租用时间为300秒，流速为2μL /秒，微阵列的表面通过Gly‑HCl（10mM, pH = 2.0）以3μL /秒的再生速率再生300秒，实验由Plexera SPRi系统实时监测，系统的响应与结合到小分子的蛋白质的质量正相关；（10）统计分析：利用SPSS17.0统计软件，计量资料呈正态分布且符合方差齐性，采用单因素方差分析，用均数±标准差（x±SD）表示，以P>0.05表示无统计学意义，P<0.05为差异有统计学意义，P<0.01表示有非常显著性统计学意义。