[发明专利]一种柱前衍生化HPLC-MS/MS检测桂花中单糖含量的方法

摘要

本发明公开了一种柱前衍生化HPLC‑MS/MS检测桂花中单糖组分的方法。本发明以1‑苯基‑3‑甲基‑5‑吡唑啉酮(PMP)柱前衍生化为前处理手段，采用高效液相色谱与电喷雾电离质谱联用对桂花中的6种单糖成分进行同时测定，方法简单、灵敏、选择性高、分离效率高、进样量少、分析时间短、多模式测定等优点，为桂花中多糖的单糖成分研究提供科学依据。该方法同时为其他天然产物的研究奠定了基础。

主权项

1.一种柱前PMP衍生化HPLC‑MS/MS检测桂花中单糖组分的方法，包括步骤如下：(1)样品处理a、桂花中多糖的提取准确称取10g桂花、200ml的无水乙醇放入500ml圆底烧瓶后进行混合，80℃条件下在恒温水浴锅内冷凝回流一小时，过滤后取滤渣将此操作重复一次，再次过滤和干燥；然后再将得到的滤渣放置在1000ml的圆底烧瓶中并放入400ml的水，90℃条件下在恒温水浴锅中提取1.5h，重复两次；抽滤过后得到滤液，合并两次的滤液，将滤液在旋转蒸发仪内蒸发浓缩至150ml；将4倍体积的无水乙醇加入此浓缩的多糖溶液中，后经离心机离心15min(8000r/min)，干燥得到桂花粗多糖；将蒸馏水加入粗多糖溶解，再加入10ml的Sevage试剂(氯仿：正丁醇＝4:1)，剧烈振摇，室温下用离心机离心5min(3500r/min)；将4倍体积的无水乙醇加入取得的上清液中，沉淀用乙醇与丙酮洗涤，再经抽滤，干燥后得到桂花多糖；b、桂花中多糖的酸水解准确称取步骤a获得的桂花多糖10mg放入10ml的螺纹顶空瓶，加5ml的盐酸溶液(2mol/L)，混匀后密封，然后在90℃下水解3小时，冷却后，离心5min，取得上清液单糖样品水解液，待衍生化；c、单糖的PMP衍生化精密取桂花多糖水解液100μl，置于7ml离心管中，加入100μl1‑苯基‑3‑甲基‑5‑吡唑啉酮甲醇溶液(0.5mol/L)，充分摇匀，在70℃水浴条件下反应30min，冷却室温，再加入适量10％冰乙酸溶液调PH至中性，混匀后加1ml氯仿用于萃取过量的PMP，弃掉下层液体，此操作重复3次，离心10min(转速8000r/min)后收集上清液，最后用0.22μm滤膜过滤，稀释到1000倍后待测；精密称取单糖对照品10mg，于10ml容量瓶中，加氨水至刻度线制成1mg/mL混合单糖标准溶液，依照上述方法PMP衍生处理后待测，所述对照品为甘露糖、核糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、岩藻糖；分别精密称取单糖对照品10.0mg放入到10ml容量瓶中加入5ml氨水，配成2mg/ml的混合标准溶液；然后进行稀释得到一系列标准溶液，浓度依次为2μg/ml，200ng/ml，100ng/ml，50ng/ml，20ng/ml，2ng/ml吸取各个标准系列溶液100μl，依照上述方法PMP衍生处理后待测；(2)用高效液相色谱质谱联用仪检测：a、高效液相色谱HPLC的条件为色谱柱型号Shim‑pack VP‑ODS6022748(150L×2.0)，柱温及检测器温度：30℃；流速：0.2mL/min；流动相：5mmol/L乙酸铵‑乙腈，梯度洗脱程序：0‑5mim17％乙腈；5‑10min18％乙腈；10‑15min19％乙腈；15‑19min21％乙腈；19‑25min18％乙腈25‑40min15％乙腈；进样量：2μl；b、质谱MS/MS条件为离子源：电喷雾离子源，检测模式：正离子模式；加热块温度：400℃；DL加热管温度：250℃，扫描时间：0.1s，扫描模式：一级质谱Q3扫描，质谱扫描范围m/z100‑1000、二级质谱产物离子扫描、多反应检测(multiple reaction monition,MRM)模式定量分析，电喷雾电压：3.5KV，雾化气体：N2，雾化气流速：3.0L/min，干燥器流量：15.0L/min，碰撞气体：高纯氮气，碰撞气压力：230Kpa；(3)定性检测：取步骤(1)c经PMP衍生处理后6种单糖对照品的混合溶液，于步骤(2)条件下及如表1设定的质谱参数下进样测定；将步骤(1)c经PMP衍生处理后的桂花样品进样于上述条件下测定：样品经液相分离、质谱离子化后，根据表1中每种单糖的保留时间、分子量、准分子离子峰等质谱参数对样品进行不同单糖及含量的确证；表1正离子模式下单糖标准品衍生化产物的主要质谱参数(4)定量检测：取步骤(1)c经PMP衍生处理后的一系列不同质量浓度的6种单糖对照品的混合溶液，于高效液相色谱质谱联用仪设定的条件下分别进样测定，重复6次，测定其对应浓度的色谱峰面积，进行线性回归，得到回归方程，相关系数和线性范围见表2；用线性方程对样品进行定量，样品中单糖的响应值应在仪器检测的线性范围内；表2混合单糖标准品的标准曲线、线性范围