[发明专利]一种Nanos2启动子核心区域关键转录因子的验证方法

摘要

本发明公开了一种Nanos2启动子核心区域关键转录因子的验证方法：首先，对Nanos2 5’侧翼区序列进行PCR扩增，构建真核表达载体pNanos2‑EGFP，将pNanos2‑EGFP、pEGFP‑N1、pLinker‑EGFP分别转染DF‑1细胞，以对Nanos2启动子区定性分析；分别构建启动子5’端不同长度缺失载体pGL3‑1187、pGL3‑959、pGL3‑788、pGL3‑493、pGL3‑155与pRL‑SV40共转染DF‑1细胞，进行双荧光素酶报告基因检测以对Nanos2启动子核心区域进行鉴定，构建缺失核心区域载体，再次进行双荧光素酶活性分析，观察是否缺失核心区域后启动子活性丧失或显著降低；对Nanos2启动子核心区域进行转录因子结合位点预测，进行双荧光素酶报告分析和CHIP试验确定关键转录因子。通过细胞形态学观察、qRT‑PCR、细胞免疫化学、流式细胞分析等方法检测雄性生殖细胞分化情况。

主权项

1.一种Nanos2启动子核心区域关键转录因子的验证方法，其特征在于：包括如下步骤：（1）Nanos2启动子区域活性定性检测对Nanos2基因5’侧翼区‑2bp~‑1189bp进行PCR扩增，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳，切胶回收，构建到经AseⅠ、KpnⅠ双酶切后的pEGFP‑N1载体中，重组质粒pNanos2‑EGFP经单、双酶切、菌液PCR鉴定后，阳性样品送测，核酸测序比对后表明重组载体构建成功；将pNanos2‑EGFP、pEGFP‑N1分别转染DF‑1细胞，转染24h后，荧光倒置显微镜下观察，以对启动子活性区域进行定性检测；（2）Nanos2启动子核心区域鉴定通过PCR方法扩增出了Nanos2启动子5’端不同长度缺失片段1187bp、959bp、788bp、493bp、155bp，构建启动子系列缺失载体；系列缺失载体经Sma I、Kpn I双酶切、菌液PCR鉴定后，阳性样品送测，载体构建成功后分别命名为pGL3‑1187、pGL3‑959、pGL3‑788、pGL3‑493、pGL3‑155；将启动子系列缺失载体分别与pRL‑SV40共转染DF‑1细胞，同时转染pGL3‑basic组作为阴性对照，进行双荧光素酶报告分析检测各启动子缺失片段活性，以期筛选到核心区域，为了进一步验证核心区域，构建缺失核心区域载体，再次进行双荧光素酶活性分析，观察是否缺失核心区域后启动子活性丧失或显著降低；（3）Nanos2启动子核心区域关键转录因子的确定对Nanos2启动子核心区域进行转录因子结合位点预测，通过筛选，预测‑157~‑495bp之间存在重要转录因子结合位点FoxD3、Nobox；利用同源重组技术，分别构建FoxD3、Nobox候选转录因子结合位点缺失载体，经测序，结果与预期一致，表明载体构建成功，将成功构建的缺失载体分别命名为pGL3/493‑ FoxD3、pGL3/493‑ Nobox，分别与pRL‑SV40共转染DF‑1细胞，设置pGL3/493组为阳性对照，pGL3‑basic组为阴性对照，进行双荧光素酶报告分析和CHIP试验，以确定关键转录因子；（4）关键转录因子调控作用体外验证分别构建关键转录因子结合位点缺失和过表达载体，在无饲养层RA诱导体系下进行体外验证；通过细胞形态观察、荧光定量检测、间接免疫荧光检测、流式细胞分析的方法对雄性生殖细胞的生成进行检测。