[发明专利]一套纳米生物靶向诊断反应器检测GP73、Nrp1、Frz肿瘤标志物方法及应用

摘要

本发明公开一套纳米生物靶向诊断反应器检测GP73、Nrp1、Frz肿瘤标志物方法及应用，属于基因工程、免疫学和肿瘤学技术领域。这是一种采用基于纳米金探针的酶联免疫吸附试验用于抗GP73、NRP1、Frz抗体高灵敏检测的信号放大策略，本探针由HRP酶标记的羊抗人IgG抗体高负载于纳米金表面形成，且稳定性好，易制备。在检测进程中，首先利用基因工程菌表达纯化可溶性肝细胞癌相关抗原GP73、NRP1、Frz，并以此蛋白作为抗原，分别检测肝细胞癌、肝炎、肝硬化、肝良性肿瘤及正常人血清中抗GP73、NRP1、Frz抗体的水平。在肿瘤诊断、肿瘤预后与监测的评估中具有较广阔的应用前景。

主权项

1.一套纳米生物靶向诊断反应器检测GP73、Nrp1、Frz肿瘤标志物方法，其特征在于：所述纳米生物靶向诊断反应器是由羊抗人IgG修饰的纳米金探针组成，所述探针的制备方法包括以下步骤：1）融合蛋白的纯化将经IPTG诱导表达5 h的菌液离心重悬超声后的上清与直链淀粉树脂结合后过柱，分别收集第一次过柱后的产物，洗涤后的产物以及洗脱产物，并以超声后的上清作为对照，各组均进行SDS‑PAGE凝胶电泳分析，当上清中的大部分蛋白均与直链淀粉树脂结合，经洗涤后与直链淀粉树脂结合的目的蛋白，最后用麦芽糖溶液洗脱得到高纯度的目的融合蛋白菌种；2）信号放大探针检测系统的建立，采用酶标抗体包裹于纳米金表面合成信号放大探针（1）纳米金及探针的合成a 纳米金的合成在 500 mL 三口烧瓶中加入 250 mL水，再加入 2.5 mL 1% HAuCl4，在电炉上加热至沸腾后，快速加入4.4 mL 1%柠檬酸钠，溶液在 2～3 min 内其颜色由淡黄色—蓝色—酒红色逐渐变化，然后继续保持沸腾 10～15 min，移走热源，在室温下继续搅拌至冷却，最后定容到200 mL，置4 ℃冰箱冷藏备用；b 探针的合成a)采用0.1M的K2CO3溶液将10mL的新鲜合成的AuNPs的pH调至9.0；b)取HRP酶标记的羊抗人IgG30μL并用适量的超纯水稀释后，在不断搅拌下逐滴加入到纳米金溶液中，并于室温下静置1h，得到混合溶液，备用；c)将步骤b得到的混合溶液，在不断搅拌下逐滴加入BSA水溶液，使反应体系中BSA的最终浓度达到1%，然后在高速离心机中13500 rpm 离心20min, 弃上清；d)用含1%BSA和0.05%NaN3的PB：pH 7.4洗涤，再以13500 rpm 离心20min，弃上清，如此反复洗涤两次，得到离心沉淀物，备用；e)将步骤d洗涤后得到的离心沉淀物用5 mL含5%BSA和0.05%NaN3的PB：pH 7.4重悬，重悬后，经1000rpm离心5min，弃下层沉淀物，得到纳米金探针的合成体，置4℃冰箱保存；（2）探针的表征检测a分别取10μL新鲜制备的浓度为1nM的AuNPs纳米金溶液及酶标抗体偶联的Ab(HRP)‑AuNPs纳米金探针加超纯水稀释至1mL；b将稀释好的AuNPs、Ab(HRP)‑AuNPs置于已备好冰水共浴的超声波分散仪中，超声10min；c分别取上述超声好的100μL样品转移至洗净的石英皿中，上机检测样品的大小、分布范围、电位大小；d检测的参数：折射率1.33，介质粘度0.01，平均温度25℃，每个样品重复测量3次。