[发明专利]一种基于DNA载体的家蚕质型多角体病毒的体外构建方法

摘要

本发明公开了一种基于DNA载体的家蚕质型多角体病毒的体外构建方法。具体而言，本发明的方法包括下列步骤：1）获得家蚕质型多角体病毒基因组；2）设计并合成引物；3）获得病毒基因组S1至S10片段的cDNA；4）对cDNA进行PCR扩增；5）将扩增产物进行酶切，然后克隆到质粒载体中，获得重组质粒；6）将重组质粒进行酶切、线性化；以及7）将线性化质粒等摩尔混合，使用脂质体进行包裹并转染表达T7 RNA聚合酶的宿主细胞，进而获得体外构建的家蚕质型多角体病毒。本发明的一种基于DNA载体的家蚕质型多角体病毒的体外构建方法不但对家蚕质型多角体病毒基因组各片段的功能研究有促进作用，为体外获取家蚕质型多角体病毒提供新方法，而且也可以为构建重组质型多角体病毒生物杀虫剂的研发提供理论指导和技术支撑。

主权项

1.一种基于DNA载体的家蚕质型多角体病毒的体外构建方法，其包括下列步骤：1）获得家蚕质型多角体病毒基因组；2）根据家蚕质型多角体病毒基因组S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10片段的双链RNA的末端序列，设计并合成10对引物：PS1F/PS1R、PS2F/PS2R、PS3F/PS3R、PS4F/PS4R、PS5F/PS5R、PS6F/PS6R、PS7F/PS7R、PS8F/PS8R、PS9F/PS9R、PS10F/PS10R，其中所述引物的编号情况如下：引物PS1F对应SEQ ID NO:1，引物PS1R对应SEQ ID NO:2，引物PS2F对应SEQ ID NO:3，引物PS2R对应SEQ ID NO:4，引物PS3F对应SEQ ID NO:5，引物PS3R对应SEQ ID NO:6，引物PS4F对应SEQ ID NO:7，引物PS4R对应SEQ ID NO:8，引物PS5F对应SEQ ID NO:9，引物PS5R对应SEQ ID NO:10，引物PS6F对应SEQ ID NO:11，引物PS6R对应SEQ ID NO:12，引物PS7F对应SEQ ID NO:13，引物PS7R对应SEQ ID NO:14，引物PS8F对应SEQ ID NO:15，引物PS8R对应SEQ ID NO:16，引物PS9F对应SEQ ID NO:17，引物PS9R对应SEQ ID NO:18，引物PS10F对应SEQ ID NO:19，引物PS10R对应SEQ ID NO:20，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:20所示；3）获得S1至S10片段的cDNA；4）分别以步骤3）中获得的S1至S10片段的cDNA为模板，对应使用步骤2）中合成的10对引物进行PCR扩增，获得S1至S10片段全长cDNA的扩增产物；5）将步骤4）中获得的S1至S10片段全长cDNA的扩增产物分别使用限制性内切酶进行酶切，然后克隆到质粒载体中，获得分别带有S1至S10片段全长cDNA的重组质粒pT‑S1、pT‑S2、pT‑S3、pT‑S4、pT‑S5、pT‑S6、pT‑S7、pT‑S8、pT‑S9、pT‑S10，其中所述限制性内切酶的使用情况如下：S1片段全长cDNA的扩增产物用SacI和SacII进行酶切；S2片段全长cDNA的扩增产物用SacI和SacII进行酶切；S3片段全长cDNA的扩增产物用SacI和SacII进行酶切；S4片段全长cDNA的扩增产物用kpnI和SacII进行酶切；S5片段全长cDNA的扩增产物用kpnI和SacII进行酶切；S6片段全长cDNA的扩增产物用kpnI和SacII进行酶切；S7片段全长cDNA的扩增产物用kpnI和XbaI进行酶切；S8片段全长cDNA的扩增产物用kpnI和SacII进行酶切；S9片段全长cDNA的扩增产物用kpnI和SacII进行酶切；S10片段全长cDNA的扩增产物用kpnI和SacII进行酶切；6）将步骤5）中获得的pT‑S1至pT‑S10重组质粒分别使用限制性内切酶进行酶切，获得pT‑S1至pT‑S10的线性化质粒，其中所述限制性内切酶的使用情况如下：重组质粒pT‑S1用SacII进行酶切；重组质粒pT‑S2用SacII进行酶切；重组质粒pT‑S3用SacII进行酶切；重组质粒pT‑S4用SacII进行酶切；重组质粒pT‑S5用SacII进行酶切；重组质粒pT‑S6用SacII进行酶切；重组质粒pT‑S7用XbaI进行酶切；重组质粒pT‑S8用SacII进行酶切；重组质粒pT‑S9用SacII进行酶切；重组质粒pT‑S10用SacII进行酶切；7）将步骤6）中获得的pT‑S1至pT‑S10的线性化质粒等摩尔混合，使用脂质体进行包裹并转染表达T7 RNA聚合酶的宿主细胞，待观察到细胞质内形成多角体时，收集细胞并破碎，离心纯化，获得体外构建的家蚕质型多角体病毒。