[发明专利]一种KIR及配体基因分型实验方法

摘要

本发明公开了一种KIR及配体基因分型实验方法，本发明技术省时省力，同时还节省DNA样本量。采用多重PCR技术，同时还根据PCR产物的大小，对36对引物进行组合，最终在12个反应孔中完成扩增反应。方便应用于96孔板的扩增，使用常规的Taq酶，可在相同的反应条件下一次完成所有KIR基因及其配体的分型，大大增加了其实用性。对于KIR基因采用两对引物，提高了准确率，避免了假阴性结果。KIR基因可与靶细胞表面的MHC‑I类配体分子结合，传导抑制或激活信号来调节NK细胞和T细胞活性，在造血干细胞移植、母胎耐受、抗感染免疫、肿瘤免疫及自身免疫性疾病中发挥重要调节作用。因此，KIR基因分型有助于了解KIR对肿瘤免疫、造血干细胞移植以及自身免疫性疾病的影响。

主权项

1.一种KIR及配体基因分型实验方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）基因组DNA提取：采用基因组TIANamp Blood DNA Kit提取试剂盒，进行基因组DNA的提取；（2）PCR扩增KIR及配体基因：试剂准备：DNA 模板；对应目的基因的特异引物；10×PCR Buffer；2.5mM dNTPmix：含 dATP、dCTP、dGTP、dTTP 各 2.5mM；25mM MgCl2；水：高压灭菌去离子水；Taq DNA聚合酶：5U/μl；操作步骤：1.1将上述PCR试剂在冰浴中融化，并在旋涡振荡器上混匀试剂，短暂离心；1.2配制PCR MIX；1.3每个实验样本的KIR和配体的基因按照表2的引物组合分成12个反应组；每个反应组的体系是10μl；a配制PCR MIX时，按照13个反应组计算，因为要考虑实验中的损耗；b先将12个反应组的引物依次加入96孔板中，每个孔2μl；c取一0.5ml 的高压灭菌的离心管配制PCR MIX，组成如下：10×PCR buffer                  1.0×13=13μldNTP Mix(2.5mM)                 0.8×13=10.4μlMgCl2(25mM)                      0.6×13=7.8μl模板DNA                         0.8×13=10.4μlTaq DNA聚合酶(5U/μl)            0.05×13=0.65μl灭菌去离子水                    4.75×13=61.75μld将配制PCR MIX放置于旋涡混匀器上震荡混匀，离心；然后向每个反应中加入8μl PCR MIX；e视 PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油；如加入石蜡油，须将96孔板进行重离心，使液体沉入管底部；f设定反应程序；将上述混合液稍加离心，立即置 PCR 仪上，执行扩增；程序如下：94℃/3min 预变性；94℃/15s，65℃/15s，72℃/30s共循环5次；94℃/15s，60℃/15s，72℃/30s共循环22次；94℃/15s，55℃/1min，72℃/2min共循环4次；72℃/7min；结束反应，PCR 产物放置于4℃待电泳检测或‑20℃长期保存；（3）PCR扩增产物电泳并观察结果：电泳缓冲液配制：10×TBE Buffer（PH8.3）；组分浓度：890mM Tris‑硼酸，20mM EDTA；配制量：1L配置方法：称量下列试剂，置于1L烧杯中；Tris 108g；Na2EDTA·2H2O 7.44g；硼酸 55g；A向烧杯中加入约800ml的去离子水，充分搅拌溶解；B加去离子水将溶液定容至1L后，室温保存；琼脂糖凝胶的配制：C配制适量的电泳及制胶用的缓冲液：0.5×TBED根椐制胶量及凝胶浓度，准确称量琼脂糖粉，加入适当的锥形瓶中；具体凝胶浓度为2%，即100ml TBE加入2克的琼脂糖粉末；E加入一定量的电泳缓冲液(总液体量不宜超过锥形瓶的50%容量)；F在锥形瓶的瓶封上保鲜膜，并在膜上扎些小孔，然后在微波炉中加热熔化琼脂糖；加热过程中，当溶液沸腾后，请戴上防热手套；小心摇动锥形瓶；使琼脂糖充分均匀熔化；此操作重复数次，直至琼脂糖完全熔化；G使溶液冷却至60℃左右，如需要可在此时加入溴乙锭溶液(终浓度0.5µg/ml)；并充分混匀；H将琼脂糖溶液倒入制胶模中，然后在适当位置处插上梳子；凝胶厚度一般在3~5mm之间；I在室温下使胶凝固(大约30min~1h)，然后放置于电泳槽中进行电泳；上样缓冲液配制（6×Loading Buffer）组份            浓度EDTA            30mM甘油            36%（V/V）二甲苯腈蓝FF    0.05%（W/V）溴酚蓝          0.05%（W/V）配制量：500ml配制方法：称量下列试剂，置于500ml烧杯中；EDTA 4.4g；二甲苯腈蓝FF 250mg；溴酚蓝 250mg；向烧杯中加入约200ml的去离子水后，加热搅拌充分溶解；加入180ml的甘油后，使用2N NaOH调节pH值至7.0；用去离子水定容至500ml后，室温保存；在PCR产物中加入适量上样缓冲液，混匀；取5μl该混合物加入凝胶点样孔中，再加入低分子量DNA Ladder作为DNA Marker；调节电源，设置电压为140V，电泳50分钟，电泳结束后，将凝胶放凝胶成像仪上拍摄记录并保存结果。