[发明专利]茶树坏死环斑病毒的全基因序列及其检测方法

摘要

本发明公开了一种茶树坏死环斑病毒及其全基因序列，以及茶树坏死环斑病毒的检测方法，所述的茶树坏死环斑病毒基因组组序列及编码蛋白序列如SEQ ID NO:1所示，根据病毒的全基因序列设计出4对引物，并建立了病毒的定性和定量检测，本发明设计的引物具有特异性强、结果可靠，在普通PCR检测和荧光定量PCR检测中都有稳定可靠的表现，本发明所提供的引物信息及检测方法，可以为生产中快速鉴定存在叶色变异的茶树品种是否感染了茶树坏死环斑病毒提供快速可靠的检测方法，也为科学研究中对病毒含量的准确检测提供了依据。

主权项

1.茶树坏死环斑病毒，其特征在于，该病毒基因组序列及编码蛋白序列如SEQ ID NO:1 所示。

2.如权利要求1所述的茶树坏死环斑病毒的全基因序列，其特征在于，茶树坏死环斑病毒的基因组序列一共包含4段，对应为TPNRBV‑RNA1，TPNRBV‑RNA2，TPNRBV‑RNA3，TPNRBV‑RNA4，每段末端均有长度不一的poly(A)结构，TPNRBV‑RNA1，TPNRBV‑RNA2，TPNRBV‑RNA3，TPNRBV‑RNA4 序列的长度分别为5922 nt，4107 nt，2678 nt，2272ntt。

3.如权利要求2所述的茶树坏死环斑病毒的全基因序列，其特征在于，TPNRBV‑RNA1在第135‑5720碱基位置存在完整的开放阅读框，编码一个1861个氨基酸残基的甲基转移酶和解旋酶复合体；TPNRBV‑RNA2在第120‑3755碱基位置存在完整的开放阅读框，编码一个1211个氨基酸残基的解旋酶‑RNA聚合酶复合体；TPNRBV‑RNA3则包含4个开放阅读框，分别编码123、250、195和210个氨基酸长度的未知功能蛋白；TPNRBV‑RNA4在第384‑1331碱基位置存在完整的开放阅读框，编码一个315个氨基酸残基的移动蛋白。

4.用于检测权利要求1所述茶树坏死环斑病毒的特异性PCR引物，其特征在于，针对病毒基因组的4个片段对应设计了4对引物序列：

。

5.基于普通定性PCR检测和荧光定量PCR检测如权利要求1所述茶树坏死环斑病毒的方法，其特征在于，利用权利要求4所述的引物进行普通定性PCR和荧光定量PCR检测。

6.如权利要求5所述的检测方法，其特征在于包括以下步骤：

A：提取病毒感染的茶树叶片总RNA；

B：利用反转录试剂盒以兼并引物N25为合成引物，按照试剂盒要求合成cDNA模板；

C:将终产物稀释到800 µl 后用于普通定性PCR检测和荧光定量PCR检测。

7.如权利要求6所述茶树坏死环斑病毒的定性和定量检测方法，其特征在于所述普通定性PCR检测反应体系如下：

反应程序为：95℃ 3 min；95℃ 15 s, 52℃ 15 s, 72℃ 30 s，共35个循环；72℃ 2 min 后结束程序；

检测方法为：向上述10 µl PCR反应产物中加入2 μL 6xloading buffer，混匀后用1%凝胶电泳检测产物条带，用100‑1000 bp范围的ladder作为片段大小对照标准。

8.如权利要求6所述茶树坏死环斑病毒的定性和定量检测方法，其特征在于所述荧光定量PCR反应体系如下：

反应程序为： 95℃ 10 min；95℃ 20 s ，52℃ 10 s，70℃ 35 s，35个循环；溶解曲线检测温度65℃ ‑95℃ 。